Гибридизация РНК вирусов в тканевых срезах. Гибридизация in situ РНК замороженных срезов

Можно использовать как замороженные, так и парафиновые срезы. Следует, однако, помнить, что РНК очень чувствительна к действию фиксаторов: длительная фиксация биоптатов в формалине может привести к полному ее разрушению, поэтому лучше применять замороженные срезы. Процедура гибридизации описана в протоколе.

Гибридизация in situ РНК замороженных срезов с S-РНК-зондами. Работая со стеклами, надевают перчатки. Используют воду, обработанную ДЭПК, и стерильные маточные растворы реагентов при комнатной температуре,

Материалы
• Тритон Х-100
• 20 х SSPE: 3,6 М NaCl, 0,2 М Na2P04, 0,02 М ЭДТА, рН 7,2
• Дрожжевая тРНК: 10мг/мл
• Буфер для промывания: 6 х SSPE, 50% формамид
• Буфер НТЭ: 0,5 М NaCl, 10 мМ трис-HCl, рН 7,5,1 мМ ЭДТА
• Раствор РНКазы: маточный раствор (! 0 мг/мл), прокипяченый перед использованием

Методика
A. Приготовление срезов, где обсуждается фиксация срезов:
1. Фиксируют ткань 4% (в/о) параформальдегидом, растворенным в ФСБ.
2. Готовят толстые срезы (4—6 мкм) и помешают их на силиконированные предметные стекла.
3. Высушивают срезы на воздухе.
4. Обрабатывают препараты 0,2% тритоном Х-100 в ФСБ в течение 15 мин.
5. Промывают в двух сменах ФСБ, по 3 мин в каждой.

гибридизация вирусов рнк

Б. Обработка срезов перед гибридизацией:
1. Наносят на срезы раствор протеиназы К(1-10мкг/мл)и инкубируют препараты во влажной камере при 37 °С в течение 15 мин.
2. Промывают препараты в двух сменах ФСБ, по 3 мин в каждой.
3. Промывают препараты в 0,1 М ТЭА, рН 8,0, 3 мин, а затем добавляют уксусный ангидрид (3 мкл на 300 мл раствора) и инкубируют 10 мин при комнатной температуре.
4. Дважды по 2 мин промывают препараты в 2 х SSC.
5. Дегидратируют препараты в батарее спиртов: 50%, 70%, 95% и абсолютном этаноле, по 3 мин в каждом, затем высушивают на воздухе.

B. Гибридизация:
1. Готовят следующую смесь.
• Деионизованный формамид
• Декстрансульфат
• 20 х SSPE
• Дрожжевая тРНК (10 мг/мл)
Этого объема достаточно для получения 2 мл раствора зонда.

2. Добавляют нужный объем раствора зонда, так чтобы конечная его концентрация составила 0,3 нг/мкл, и доводят объем до 2 мл водой, обработанной ДЭПК. Радиоактивность зонда на препарат должна составлять (1—5) • 105имп. • миг1.
3. Наносят зонд на срез, накрывают покровным стеклом и по периметру обмазывают стекла резиновым клеем.
4. Инкубируют в герметичной камере с высокой влажностью при 50 "С; время инкубации подбирают опытным путем.
5. Снимают покровные стекла.

Промывание препаратов:
1. Помещают препараты в штатив и погружают их на 1 ч в буфер 1 х НТЭ при 50 °С.
2. Помещают препараты в свежий 1 х НТЭ еше на 1 ч.
3. Переносят препараты в 0,5 х НТЭ и выдерживают при 37 °С в течение 5 мин.
4. Переносят препараты в 0,5 х НТЭ, содержащий РНКазу (20 мкг/мл), и выдерживают при 37 °С в течение 30 мин.
5. Промывают препараты (в общей сложности в течение 30 мин) при 37 °С в пяти сменах 0,5 х НТЭ, содержащем ДТТ (добавляют к 250 мл НТЭ 250 мкл 1 М ДТТ).
6. Дегидратируют препараты в батарее спиртов: 50%, 70%, 95%, абсолютный этанол, по 3 мин в каждом.
7. Высушивают препараты на воздухе и проводят радиоавтографию.

- Читать далее "Гибридизация вирусов с биотинилированными ДНК-зондами. Техника гибридизации вирусов с биотинилированными зондами"

Оглавление темы "Диагностика вирусов. Методы выявления РНК и ДНК вирусов":
1. Денатурация для выявления вирусов. Системы детекции вирусов
2. Контроль специфичности гибридизации in situ. Гибридизация ДНК в вирусных препаратах
3. Гибридизация ДНК вирусов в гистологических срезах. Гибридизация in situ ДНК парафиновых срезов с S-зондами
4. Гибридизация вирусов в парафиновых срезах. Радиоавтография вирусов в парафиновых срезах
5. Гибридизация РНК вирусов в тканевых срезах. Гибридизация in situ РНК замороженных срезов
6. Гибридизация вирусов с биотинилированными ДНК-зондами. Техника гибридизации вирусов с биотинилированными зондами
7. Оценка результатов гибридизации вирусов. Чувствительность гибридизации in situ
8. Диагностика вируса папилломы человека. Диагностика цитомегаловируса и вируса простого герпеса
9. Диагностика вируса гепатита В. Диагностика вируса иммунодефицита человека
10. Генетика опухолевых клеток. Методы анализа генома опухолевых клеток

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: