Гибридизация вирусов в парафиновых срезах. Радиоавтография вирусов в парафиновых срезах

1. Наносят на срезы нужное количество раствора зонда (15—30 мкл) и сразу же закрывают их покровными стеклами.
2. Запаивают стекла в пластиковый пакет и инкубируют примерно 6 мин при 110-120 °С (чтобы произошла денатурация зонда и ДНК-мишени), пока температура стекол не достигнет 93°С (ее контролируют с помощью термометра, помещенного в непосредственной близости со стеклами). Вынимают стекла.
3. Промазывают стекла по краям резиновым клеем, используя шприц без иглы.
4. Запаивают стекла в пластиковый пакет, в который налито немного раствора с такой же концентрацией солей, как у буфера для гибридизации. Инкубируют 40 ч при 37—50 °С в зависимости от жесткости условий гибридизации.
5. С помощью иглы подцепляют и одним движением снимают покровное стекло; сразу же опускают препарат в первую смену раствора для промывания.

Промывание препаратов:
1. Промывают препараты в трех сменах раствора, содержащего 2 х SSC, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, по 5 мин в каждой.
2. Промывают препараты в двух сменах раствора, содержащего 0,5 х SSC, 1 мМ ЭДТА, 10 мМ ДТТ, по 5 мин в каждой.
3. Промывают препараты в двух сменах раствора, содержащего 0,5 х SSC, 1 мМ ЭДТА, по 5 мин в каждой.
4. Промывают препараты, помещенные в штатив, в смеси 50% формамида и 50% концентрированного солевого раствора (см. Материалы) в течение 10 мин.

5. Промывают препараты в четырех сменах 0,5 х SSC при 55 °С, по 5 мин в каждой.
6. Промывают препараты b 0,5xSSC в течение 5 мин при комнатной температуре.
7. Дегидратируют препараты в 70% этаноле и в 95% этаноле, по 5 мин в каждом.
8. Высушивают стекла на воздухе.

гибридизация вирусов

Радиоавтография вирусов в парафиновых срезах

1. Закрепляют стекла в пластиковых штативах.
2. Подготавливают следующие посуду и препараты:
- светонепроницаемую коробку для штатива со стеклами;
- стакан объемом 50 мл;
- флакон с фотоэмульсией Kodak № 165-4441;
- шпатель и бюхнеровскую газовую горелку;
- стакан объемом 50 мл с 25 мл 0,6 М ацетата аммония.

3. Выключают свет, достают из коробки флакон с фотоэмульсией и помешают его в водяную баню на 50 °С, чтобы эмульсия расплавилась.
4. При красном свете (фильтр № 2) заполняют стакан с ацетатом аммония фотоэмульсией доверху и осторожно перемешивают шпателем.
5. Над горелкой переливают эту смесь в пустой стакан, чтобы удалить пузырьки воздуха.
6. На секунду опускают штатив со стеклами в эмульсию и промокают края стекол фильтровальной бумагой. Помещают штатив в коробку и оставляют сохнуть до утра.
7. Насыпают на дно коробки силикагель и продолжают экспонировать при 4 °С в течение 3—7 сут в зависимости от удельной радиоактивности зонда и количества ДНК-мишени.

8. Проявляют препараты в темноте, поочередно инкубируя их в следующих растворах:
• проявитель (D-19, Kodak): 5 мин при 15 °С;
• фиксатор A (Kodak 3000): несколько секунд;
• быстрый фиксатор: 5 мин;
• вода: 5 мин.
Включают свет.

9. На 1—2 мин опускают стекла в раствор гематоксилина Джилла.
10. Опускают стекла на 2 мин в сосуд с большим количеством воды.
11. Промывают препараты в проточной воде.
12. Дегидратируют препараты в трех сменах 70%, 95% и абсолютного этанола, по 3 мин в каждой, затем в двух сменах ксилола, по 10 мин в каждой, и заключают их в среду типа Permount.

- Читать далее "Гибридизация РНК вирусов в тканевых срезах. Гибридизация in situ РНК замороженных срезов"

Оглавление темы "Диагностика вирусов. Методы выявления РНК и ДНК вирусов":
1. Денатурация для выявления вирусов. Системы детекции вирусов
2. Контроль специфичности гибридизации in situ. Гибридизация ДНК в вирусных препаратах
3. Гибридизация ДНК вирусов в гистологических срезах. Гибридизация in situ ДНК парафиновых срезов с S-зондами
4. Гибридизация вирусов в парафиновых срезах. Радиоавтография вирусов в парафиновых срезах
5. Гибридизация РНК вирусов в тканевых срезах. Гибридизация in situ РНК замороженных срезов
6. Гибридизация вирусов с биотинилированными ДНК-зондами. Техника гибридизации вирусов с биотинилированными зондами
7. Оценка результатов гибридизации вирусов. Чувствительность гибридизации in situ
8. Диагностика вируса папилломы человека. Диагностика цитомегаловируса и вируса простого герпеса
9. Диагностика вируса гепатита В. Диагностика вируса иммунодефицита человека
10. Генетика опухолевых клеток. Методы анализа генома опухолевых клеток

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: