Гибридизация ДНК вирусов в гистологических срезах. Гибридизация in situ ДНК парафиновых срезов с S-зондами

Обычно мы обрабатываем в одном опыте 144 препарата, включая контроль. Они нанесены на 48 предметных стекол, помещаемых в штатив.
Гибридизация in situ ДНК парафиновых срезов с S-зондами. Используют только силиконированные стекла. Срезы размещают на трети стекла, удаленной от матового конца.

Материалы
- Протеиназа К: лиофильно высушенный порошок (Boehringer Mannheim)
- ФСБ: 10 мМ фосфатный буфер, 150 мМ NaCl, pH 7,2
- 2 М трис-HCl, рН 7,4
- БСА, очищенный от нуклеаз: 50 мг/мл
- ПВП: 10% (в/о) раствор в дистиллированной воде
- Фиколл: 10% (в/о) раствор в дистиллированной воде

- ДНК-носитель, например рестрицированная ДНК сельди или лосося: 2 мг/мл
- 0,1 МДТТ
- Деионизованный формамид
- 20 х SSC: 3 М NaCl, 0,3 М цитрат натрия, рН 7,0
- Концентрированный солевой раствор: 0,5 М NaCl, 10 мМ трис-HCl, рН 7,4, 1 мМ ЭДТА
- Фотоэмульсия и растворы для проявления
- Раствор для промывания препаратов, заменяющий проточную воду: 200 мл воды, в которой растворено 4 г NaHCO3 и 40 г MgS04*7H20.

гибридизация днк

Методика
А. Предварительная обработка препаратов (используют штативы на 20—48 стекол)
1. Прогревают срезы при 60 С не менее 2 ч или оставляют их при той же температуре на ночь.

2. Удаляют из срезов парафин, используя следующие реактивы:
- ксилол (обязательно свежий): две смены, по 10 мин в каждой;
- абсолютный этанол: две смены, по 5 мин в каждой;
- 95% этанол: две смены, по 5 мин в каждой; - 70% этанол: две смены, по 5 мин в каждой.

3. Высушивают срезы на воздухе примерно 10 мин.
4. На каждый срез наносят пипеткой 100—200 мкл раствора протеиназы К (0,5—1,0 мг/мл) и инкубируют 15 мин во влажной камере при 37 С.
5. Промывают препараты в пяти сменах ФСБ, по 2 мин в каждой, и высушивают их на воздухе.

Приготовление раствора зонда

1. Концентрация зонда (нг/мкл) и его удельная радиоактивность должны быть известны из процедуры приготовления раствора.
2. Определяют объем раствора, достаточный для нанесения на все препараты при данном размере стекол.

3. Раствор должен иметь следующие характеристики:
• 1 нг/мкл ДНК
• 2 108 имп. • мин_1/мкл

4. Вычисляют необходимый объем маточного раствора зонда, исходя из известного конечного объема (V, мкл) и концентрации зонда в маточном растворе (Р, нг/мкл):
Необходимый объем маточного раствора = V/P

5. Проверяют соответствие удельной радиоактивности требованию п. 3 по следующей формуле:
• Удельная радиоактивность конечного раствора = (имп. мин-1/мкл) • 1СИ = (имп. мин-1/мкл) * 1/P
Полученная величина должна быть равна или больше 2 108 имп. мин_1/мкл, в противном случае необходимо увеличить время экспозиции при радиоавтографии.

6. В эппендорфовскую пробирку с 1 мл деионизованного формамида добавляют 0,2 г декстрансульфата, встряхивают и прогревают в водяной бане при 60 °С до растворения.
7. Готовят следующую смесь:
• 5 М NaCl 240 мкл
• 2 М трис-HCl, рН 7,4 10 мкл
• 0,5 М ЭДТА 2 мкл
• 50 мг/мл БСА 40 мкл • 10%(в/о)ПВП 4 мкл
• 10% (в/о) фиколл 4 мкл
• ДНК-носитель 2 мг/мл 200 мкл • 0,1МДТТ 20 мкл
Перемешивают смесь встряхиванием.

8. Добавляют раствор декстрансульфата в формамиде и перемешивают встряхиванием. Полученной смеси достаточно для 2000 мкл раствора зонда.
9. Добавляют нужный объем маточного раствора зонда и доводят объем до 2 мл дистиллированной водой. Раствор для гибридизации имеет следующий состав: 50% формамид, 10% (в/о) декстрансульфат, 0,6 М NaCl, 0,01 М трис-HCl, рН 7,4, 0,5 мМ ЭДТА, 1 мг/мл (в/о) БСА, 0,02% (в/о) фиколл, 0,02% (в/о) ПВП, 0,2 мг/мл ДНК спермы лосося, 0,5 мМ ДТТ.

- Читать далее "Гибридизация вирусов в парафиновых срезах. Радиоавтография вирусов в парафиновых срезах"

Оглавление темы "Диагностика вирусов. Методы выявления РНК и ДНК вирусов":
1. Денатурация для выявления вирусов. Системы детекции вирусов
2. Контроль специфичности гибридизации in situ. Гибридизация ДНК в вирусных препаратах
3. Гибридизация ДНК вирусов в гистологических срезах. Гибридизация in situ ДНК парафиновых срезов с S-зондами
4. Гибридизация вирусов в парафиновых срезах. Радиоавтография вирусов в парафиновых срезах
5. Гибридизация РНК вирусов в тканевых срезах. Гибридизация in situ РНК замороженных срезов
6. Гибридизация вирусов с биотинилированными ДНК-зондами. Техника гибридизации вирусов с биотинилированными зондами
7. Оценка результатов гибридизации вирусов. Чувствительность гибридизации in situ
8. Диагностика вируса папилломы человека. Диагностика цитомегаловируса и вируса простого герпеса
9. Диагностика вируса гепатита В. Диагностика вируса иммунодефицита человека
10. Генетика опухолевых клеток. Методы анализа генома опухолевых клеток

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: