Денатурация — один из ключевых этапов гибридизации in situ, особенно при работе с парафиновыми срезами. Ее необходимо проводить при строго определенной температуре. Для контроля температуры на стеклах мы пользуемся термометром со шкалой 82-93 С; температура в денатурационной камере поддерживается в диапазоне 100— 110 С. Время инкубации для замороженных срезов составляет 3—5 мин, для парафиновых — 6—10 мин. Не следует нагревать препараты выше 100 С — это ухудшает их качество. Время денатурации не должно превышать 10 мин, чтобы не допустить подсыхания срезов, которое неизбежно приведет к увеличению фона. В опытах по гибридизации с внутриклеточной ДНК срезы выдерживают 10 мин при температуре не ниже 90 С, чтобы вся ДНК заведомо денатурировала.

Условия гибридизации. Никаких универсальных условий для гибридизации in situ не существует, есть только некие общие правила, описанные в соответствующих протоколах. Более подробно этот вопрос рассматривается в гл. 4. Мы советуем проводить гибридизацию в достаточно жестких условиях, т. е. в диапазоне температур от Тт —10 до Tm-17 С.

Промывание препаратов после гибридизации. В ходе гибридизации зонд образует дуплексы как с полностью гомологичными последовательностями, так и с последовательностями, степень гомологии которых с ним не очень высока. Чтобы удалить зонд из несовершенных дуплексов, препараты после гибридизации отмывают в достаточно жестких условиях. Жесткость можно менять, варьируя концентрацию солевого буфера и формамида, а также температуру. Если используются радиоактивно меченные зонды, то промывание ведут весьма интенсивно, в случае же биотинилированных зондов достаточно кратковременного промывания. После гибридизации с антисмысловыми РНК-зондами целесообразно обработать срезы РНКазой, которая гидролизует негибридизовавшийся одноиепочечный зонд.

Радиоактивные зонды. В этом случае для детекции применяют радиоавтографию. Время экспозиции препаратов зависит от следующих факторов:
• используемого изотопа;
• удельной активности зонда;

Обычно для обнаружения гетеродуплексов используют два радиоавтографических метода. В первом случае к стеклам с препаратами плотно прижимают рентгеновскую пленку, экспонируют ее нужное время и проявляют. Во втором стекла покрывают слоем фотоэмульсии, выдерживают их в темноте и затем проявляют. Последний метод используется в основном для обнаружения в клинических препаратах микроорганизмов (вирусов и бактерий), а первый —для локализации мРНК.

Нерадиоактивные зонды. Для выявления различных генов и вирусных нуклеиновых кислот сейчас все более широко используются биотинилированные зонды. Системы детекции таких зондов хорошо отработаны, поскольку они давно используются в иммуноцитохимии. Многие зонды имеются в продаже и производятся несколькими фирмами. Для детекции биотинилированных зондов используют конъюгированный авидbн или стрептавидин, причем последний предпочтительнее, поскольку дает более низкий фон. Можно прибегнуть и к иммуноцитохимической детекции с помощью антител к биотину. Для повышения чувствительности и уменьшения неспецифического спаривания разработаны многоступенчатые системы детекции, в которых метка связывается с зондом не напрямую. Наилучшие результаты получались у нас, когда мы использовали комплекс стрептавидин — щелочная фосфатаза. Чувствительность таких комплексов, имеющихся в продаже, сильно варьирует. Частично это связано с тем, что разные препараты имеют неодинаковую удельную активность. Большинство комплексов хорошо работает при концентрации 4-10 ЕД/мл, однако для каждого препарата подходящую концентрацию следует подбирать опытным путем. Используя оптимальный ферментный комплекс, можно значительно повысить чувствительность метода гибридизации in situ. Заметим, что применение комплексов с ЩФ дает лучшие результаты, чем стандартная детекция с использованием пероксидазы хрена. Проводя гибридизацию in situ с двойной меткой, можно одновременно выявлять два разных вирусных генома.

Окрашивание. При гибридизации in situ можно использовать некоторые гистологические красители. Мы обычно работаем с красителями, окрашивающими цитоплазму, а для выявления гетеродуплексов, меченных радиоактивными изотопами, используем модифицированный гематоксилин Джилла или модифицированный фуксин. В случае биотинилированных зондов прекрасный контраст со специфическими гибридизационными сигналами дает модифицированный фуксин или метиленовый зеленый.

- Читать далее "Контроль специфичности гибридизации in situ. Гибридизация ДНК в вирусных препаратах"