Контроль в электронно-микроскопической иммуноцитохимии. Виды контроля в электронной иммуноцитохимии

Контроль в электронно-микроскопической иммуноцитохимии не менее важен, чем в световой. Он осуществляется на трех уровнях.
Контроль реагентов. Совершенно необходимо, чтобы первые антитела были специфичны по отношению к своим антигенам. Любые перекрестные реакции, например связывание с другими членами того же семейства пептидов, необходимо выявить иммунологическими методами и тестированием под световым микроскопом. Даже после такой проверки при нанесении слоя желательно поставить тест на адсорбцию, добавив к разведенному антителу избыток антигена, чтобы нейтрализовать его иммунореактивность, убедившись, что родственные антигены не взаимодействуют и, следовательно, окрашивание обусловлено специфическим взаимодействием антигена с антителом, а не каким-то случайным связыванием. Некоторые антитела связываются с оснjвными остатками, часто встречающимися в пептидах, и можно подумать, что имеет место специфическое связывание, поскольку иммунореактивность блокируется добавлением данного антигена (оснjвного пептида). Однако, если такой же эффект наблюдается при добавлении к разбавленным антителам поли-L-лизина (мол. масса 3000-6000, 2 мг/мл), то есть основание думать о неспецифическом связывании. При наличии перекрестных реакций между антителами и пептидами из того же семейства, обусловленных наличием аминокислотных последовательностей с одинаковыми антигенными свойствами, единственный выход состоит в использовании сайт-специфичных антител с уникальной антигенной последовательностью.

Отрицательный контроль. Чтобы определить уровень неспецифического связывания с тканью, первое антитело нужно заменить неимунной сывороткой или неактивными антителами.

Положительный контроль. Для каждого первого антитела проводят положительный контрольный опыт; его цель — убедиться в активности антител и в том, что можно доверять отрицательным результатам, полученным на исследуемом препарате.

Сильный фон затрудняет анализ результатов. Перечислим причины его возникновения и способы их устранения.
а. Концентрация первого антитела слишком высока:
• разводят антитело сильнее.

контроль в иммуноцитохимии

б. Иммуноглобулины связываются альдегидами, которые остались в ткани после фиксации:
• начинают мечение с 30-минутной инкубации сеточек в свежеприготовленном 1% боргидриде натрия или добавляют в блокирующий раствор хлорид аммония (50-100 мМ).

в. Иммуноглобулины связываются с заряженными участками н ткани:
• увеличивают концентрацию блокирующей сыворотки (иногда используют даже неразведенную сыворотку);
• увеличивают концентрацию хлорида натрия в буфере для разведения антител до 2,5%.

г. Реагент, конъюгированный с золотом, аккумулирует агрегаты частиц коллоидного золота:
• отделяют агрегаты центрифугированием (2000 g, 10 мин).

д. Вторые антитела дают перекрестную реакцию с иммуноглобулинами ткани хозяина:
• реактивность вторых антител подавляют добавлением к разведенным вторым антителам 1% сыворотки, полученной от вида-хозяина.

Если оставить в стороне проблему утраты антигенов при фиксации и обработке препаратов или очевидные ошибки в выполнении соответствующих операций, то для решения проблемы можно предложить несколько способов.
а. Проверяют, чтобы раствор антител, связанных с золотом, не содержал немеченых иммуноглобулинов.
б. Увеличивают время протравливания/окисления (при заключении в эпоксидные смолы).
в. Увеличивают концентрацию антител, особенно вторых.
г. Используют очень чувствительный метод, например авидин-биотиновый с антителами, меченными золотом, или — для улучшения связывания антител с антигенными сайтами — повторяют этапы окрашивания несколько раз. Усиливают золотую метку серебром.

Чтобы определить количество антигена в ткани, проще всего подсчитать частицы золота над сайтами связывания. Но содержание метки на конкретном срезе зависит от способов фиксации и обработки ткани, состава смол, степени мечения реагентов и концентрации антител по отношению к антигенам, а также от молекулярных взаимодействий между тканевыми антигенами и иммуноцитохимическими реагентами, наносимыми на препарат. Поэтому такая количественная оценка невозможна. Лучше всего, тщательно контролируя условия, провести сравнительную оценку иммунореактивности на разных препаратах, исходя из плотности мечения. Более точные количественные результаты (но тоже сравнительные) дает использование радиоактивной метки, однако радиоавтографические методы создают другие проблемы. Некоторую информацию можно получить, определив площадь, занятую иммунореактивными структурами, или число иммунореактивных клеток и гранул с помощью автоматического анализатора изображений. Но пока такая оценка остается во многом субъективной, и электронно-микроскопическая иммуноцитохимия по-прежнему является количественной методикой, по крайней мере если речь идет о выявлении пептидов нейроэндокринной системы.

- Читать далее "Гибридизация in situ. Особенности гибридизации in situ"

Оглавление темы "Электронная иммуноцитохимия. Методы окращивания":
1. Отрицательный результат в иммуноцитохимии. Нейроэндокринная система в иммуноцитохимии
2. Иммуноцитохимия нервной системы. Приготовление препаратов в иммуноцитохимии
3. Фиксация препаратов в иммуноцитохимии. Методы фиксации в иммуноцитохимии
4. Смолы в иммуноцитохимии. Фиксация препаратов смолами
5. Разведение антител в иммуноцитохимии. Хранение и использование антител
6. Иммуномечение. Непрямое иммуномечение коллоидным золотом
7. Мечение комплексом белок А — золото. Усиление с помощью серебра
8. Двойное окрашивание антителами меченными золотом. Техника двойного окрашивания антителами
9. Контроль в электронно-микроскопической иммуноцитохимии. Виды контроля в электронной иммуноцитохимии
10. Гибридизация in situ. Особенности гибридизации in situ

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: