Мечение комплексом белок А — золото. Усиление с помощью серебра

Мечение комплексом белок А — золото. Усиление с помощью серебра

Этот метод используют, когда первое антитело происходит от вида, для которого нет антитела, адсорбирующего золото. Белок А из бактерии Staphylococcus aureus связывается с Fc-участком иммуноглобулиновых молекул многих видов (но плохо связывается с крысиными и козьими иммуноглобулинами и с некоторыми подвидами человеческого и мышиного IgG). Сходным образом ведет себя и белок G, но он связывается с менее широким кругом иммуноглобулинов. Комплекс белок А (или G) с золотом обладает тем преимуществом перед антителами, связанными с золотом, что он менее склонен к агрегации и поэтому его можно разводить в буфере с рН 7,0-7,6 (содержащем 0,1% БСА и азид натрия), ФСБ. Процедура мечения описана в протоколе.

Мечение комплексом белок А — золото:
1 и 2. Аналогично соответствующим пунктам протокола. 3.Для блокирования используют инертный белок, но не сыворотку.
4. Аналогично п. 4 протокола 3.6.
5. Аналогично п. 5 протокола 3.6, с использованием в качестве промывочного буфера ФСБ.

6. Аналогично п. 6 протокола 3.6, с использованием ФСБ.
7. Инкубируют сеточки 1 ч при комнатной температуре с комплексом белок А — золото, разведенным соответствующим образом в ФСБ, содержащем БСА.
8. Промывают сеточки, как описано в п. 10 протокола, в ФСБ, содержащем БСА, затем в ФСБ и в дистиллированной воде.
9. Контрастируют срезы уранилацетатом или цитратом свинца.

Авидин-биотиновые методы. Авидин метят коллоидным золотом и, используя его очень высокое сродство к биотину, связывают с соответствующим биотинилированным вторым антителом в ходе трехэтапного процесса. Лучше использовать стрептавидин, аналогичный по своим свойствам авидину, но менее активно связывающийся с заряженными группами. Авидин-биотиновые методы высокочувствительны, поскольку в месте связывания антигена с антителом скапливается большое количество метки. Процедура мечения описана в протоколе.

Иммуномечение с помощью меченного золотом авидина:
1 и 2. Аналогично соответствующим пунктам протокола.
3. В качестве блокирующего реагента используют сыворотку.
4-6. Аналогично пп. 4-6 протокола.
7. Инкубируют срезы в течение 1 ч при комнатной температуре с биотинилированными антителами, происходящими от тех же видов, что и первые антитела, и разведенными в ФСБ или в ТСБ с БСА.
8. Тщательно промывают сеточки сначала в ФСБ или ТСБ, содержащих БСА, а затем в ФСБ или ТСБ без БСА.
9. Инкубируют срезы в течение 1 ч со стрептавидином, меченным золотом и разведенным в ФСБ или ТСБ. 10. Промывают сеточки в ФСБ, а затем в дистиллированной воде. Контрастируют срезы.

Усиление с помощью серебра

Наиболее эффективными метками являются частицы золота диаметром 1—5 нм. Однако столь мелкие гранулы трудно увидеть под микроскопом, и чтобы повысить чувствительность метода без ухудшения разрешения, их можно увеличить с помощью металлического серебра, которое аккумулируется вокруг каждой такой гранулы. Размеры этой серебряной оболочки растут экспоненциально и их необходимо контролировать добавлением в раствор гуммиарабика. Усиление серебром нежелательно использовать при окрашивании срезов, фиксированных осмием. Для проявления вполне пригодны имеющиеся в продаже проявители; состав одного из таких проявителей с ацетатом серебра приведен в протоколе.

Метод усиления серебром

Материалы:
• Маточный раствор гуммиарабика: растворяют 100 г гуммиарабика в 200 мл дистиллированной воды и перемешивают несколько часов. Оставляют раствор на 4 сут при комнатной температуре, а затем фильтруют его через несколько слоев марли. Разливают на порции и хранят при —20 °С
• Цитратный буфер: растворяют 2,35 г цитрата натрия 2Н2О и 2,55 г лимонной кислоты в 85 мл дистиллированной воды. Доводят рН до 3,8
• 1 % (о/о) уксусная кислота
• 20% тиосульфат натрия

Методика:
1. После окрашивания срезов антителами, меченными золотом, не контрастируют их, но фиксируют на сеточках 10 мин в 2% глутаральдегиде, чтобы предотвратить смывание низкоаффинных антител проявителем, содержащим ацетат серебра.
2. Тщательно промывают сеточки в дистиллированной воде,
3. Готовят серебряный проявитель из следующих компонентов:
• Ацетат серебра 10 мг
• Дистиллированная вода 5 мл
• Маточный раствор гуммиарабика 2,5 мл

Непосредственно перед использованием в проявитель добавляют гидрохинон (25 мг), растворенный в 5 мл цитратного буфера, рН ~ 3,8.

4. Помещают сеточки на капли серебряного проявителя на 1-15 мин (время проявления подбирается опытным путем).

5. Промывают сеточки в дистиллированной воде 30 с.
6. Промывают сеточки в 1% уксусной кислоте 10 с.
7. Промывают сеточки в дистиллированной воде 30 с.
8. Фиксируют срезы в 20% тиосульфате натрия в течение 3 мин.
9. Промывают сеточки в трех сменах дистиллированной воды, по 5 мин в каждой.
10. Контрастируют срезы уранилацетатом и цитратом свинца.
11. Серебряный проявитель не чувствителен к свету, поэтому проявление не нужно проводить в темной комнате при красном свете. Лучше всего использовать тонкодисперсный порошок ацетата серебра фирмы Fluka.

- Читать далее "Двойное окрашивание антителами меченными золотом. Техника двойного окрашивания антителами"