а. «Травление» пероксидом водорода, видимому, улучшает проницаемость смолы. Эта опера необязательна, если смола не до конца затвердела.
б. Для тканей, фиксированных осмием, вместо пероксида водорода используют водный раствор метапериодата (-5%), что приводит к повторному окислению осмия, он вновь становится растворимым, и блокированный антиген демаскировался. Обычно время экспозиции составляет около 10 мин, но при необходимости его можно подобрать опытным путем.
в. Сеточки должны плавать в каплях раствора срезом вниз быть погружены в раствор объемом 15 мкл, находящийся в ячейках планшета для микротестирования; в последнем случае для антител доступны обе стороны среза.

г. Все растворы следует профильтровать через миллипорофильтры с размером пор 45 нм.
д. Сеточки нужно промыть под струей воды из шприца и промокнуть микрофильтром. Если препаратов много, то помещают сеточки в ячейки с промывающим раствором на пластинах для микротестирования и осторожно встряхивая пластины на механическом встряхивателе. Несколько разрозняют раствор. Можно поместить сеточки в держатель с пронумерованными прорезями, а затем в емкость с буфером для промывки, которую слабо встряхивают. Правда, при этом приходится фильтровать очень большие объемы буфера.
е. Во время мечения сеточки не должны высыхать.

Непрямое иммуномечение коллоидным золотом ультратонких срезов, помещенных на сеточки и заключенных в аралдит или эпон

Материалы:
• 10% водный раствор пероксида водорода
• Насыщенный водный раствор метапериодата натрия (примерно 5%)
• Буферные растворы: 0,05 М трис-HCl, рН 7,4; 0,05М трис-НСl, рН 7,4, содержащий 0,1% (в/о) БСА; 0,05М трис-HCl, рН 8,2, содержащий 1% БСА
• Первые и соответствующие вторые антитела, меченные золотом
• тонометр для оценки давления в системе

Методика. 1. Для тканей, не фиксированных осмием: «протравливают» сеточки 10 мин на капле 10% пероксида водорода. Для тканей, фиксированных осмием: используют насыщенный водный раствор метапериодата натрия (10—30 мин).
2. Промывают сеточки в воде, профильтрованной через миллипоровый фильтр.
3. Промокают сеточки уголком неволокнистой фильтровальной бумаги, затем инкубируют их 30 мин в блокирующей сыворотке или белке.
4. Не промывая, осушивают сеточки, как в п.З, и инкубируют с первым антителом в соответствующем разведении I ч или оставляют на ночь при 4 °С. Оптимальное время инкубации и разведение следует подобрать опытным путем.

5. Промывают сеточки в пяти сменах 50 мМ трис-HCl, рН 7,4, примерно по 1 мин в каждой смене, со встряхиванием.
6. Промывают сеточки в трех сменах 50 мМ трис-HCl, рН 7,4, содержащего 0,1 % БСА, примерно по 1 мин в каждой смене, со встряхиванием.
7. Помещают сеточки на 10-15 мин в каплю 50 мМ трис-НС1, рН 8,2, содержащего 1% БСА.

8. Разводят меченное золотом второе антитело (например, козьи антитела к иммуноглобулину кролика) в 50 мМ трис-HCl, рН 8,2, содержащем 1% БСА, до оптимальной концентрации и 10 мин центрифугируют раствор при 200 g для удаления микроагрегатов частиц коллоидного золота.
9. В течение 1 ч инкубируют срезы в каплях супернатанта при комнатной температуре.
10. Тщательно промывают сеточки в трех сменах 50 мМ трис-НCl, рН 7,4, содержащего 0,1% БСА, примерно по 1 мин в каждой смене, затем — в пяти сменах 50 мМ трис-HCl, рН 7,4, без БСА, по 1 мин в каждой смене, и в пяти сменах дистиллированной воды, по 1 мин в каждой. На этой стадии сеточки можно высушить.
11. Контрастируют срезы уранилацетатом и цитратом свинца, как для обычной электронной микроскопии.

- Читать далее "Мечение комплексом белок А — золото. Усиление с помощью серебра"