Разведение антител в иммуноцитохимии. Хранение и использование антител

Лучше использовать апробированные первые антитела, для которых уже подобраны соответствующие разведения.
а. Чтобы уменьшить фон, обусловленный неспецифическим связыванием, используют как можно более сильные разведения поликлональных антител. Для работы с такими разведениями необходима длительная инкубация срезов с антителами (например, в течение ночи). Присутствие белковых примесей в препаратах моноклональных антител роли не играет, поэтому их сильное разведение необязательно.

б. Чтобы подобрать подходящее разведение, проверяют иммунологические реактивы, наслаиваемые во вторую и третью очередь, на заведомо позитивной ткани. Менять подобранные разведения нет необходимости, поскольку антитела всегда находятся в избытке по отношению к своим антигенам.

в. Для разведения антител используют 0,01 М фосфатный буфер, рН 7,2-7,4, содержащий 0,15 М хлорид натрия (ФСБ), или 0,05 М трис-HCl, рН 7,6, с такой же концентрацией хлорида натрия (ТСБ), содержащие около 0,1% инертного белка, например БСА (свободная от глобулинов фракция), который будет конкурировать с антителами за места неспецифического связывания на стенках посуды. Для подавления роста грибов в буфер следует также добавить азид натрия (0,01-0,1%). Этого не нужно делать при работе с реагентами, связывающими пероксидазу, поскольку азид натрия является ингибитором последней.

иммуноцитохимия

Блокирование неспецифического связывания:

Для блокирования неспецифического связывания можно предварительно проинкубировать препараты с неиммунной сывороткой, полученной от тех же видов, что и вторые антитела.

а. Если используется белок А, то сыворотка не требуется, поскольку этот белок неспецифически связывает иммуноглобулины, которые могут присутствовать в блокирующей сыворотке. Используют инертный белок, например БСА или альбумин куриного яйца.
б. В случае авидин-биотинового метода яичный альбумин лучше не использовать, поскольку он содержит авидин, который может связывать вносимый биотинилированный реагент.

Хранение и использование антител:

а. Хранят аликвоты первых антител в быстрозамороженном растворе: низкие разведения (1:10—1:50) — при -20 °С, рабочие разведения — при 4 С. Не следует

- Читать далее "Иммуномечение. Непрямое иммуномечение коллоидным золотом"

Оглавление темы "Электронная иммуноцитохимия. Методы окращивания":
1. Отрицательный результат в иммуноцитохимии. Нейроэндокринная система в иммуноцитохимии
2. Иммуноцитохимия нервной системы. Приготовление препаратов в иммуноцитохимии
3. Фиксация препаратов в иммуноцитохимии. Методы фиксации в иммуноцитохимии
4. Смолы в иммуноцитохимии. Фиксация препаратов смолами
5. Разведение антител в иммуноцитохимии. Хранение и использование антител
6. Иммуномечение. Непрямое иммуномечение коллоидным золотом
7. Мечение комплексом белок А — золото. Усиление с помощью серебра
8. Двойное окрашивание антителами меченными золотом. Техника двойного окрашивания антителами
9. Контроль в электронно-микроскопической иммуноцитохимии. Виды контроля в электронной иммуноцитохимии
10. Гибридизация in situ. Особенности гибридизации in situ

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: