Препарат ткани, предназначенный для электронно-микроскопических исследований, нужно заключить в достаточно твердый материал, чтобы можно было получить ультратонкие срезы. Для иммуноцитохимии удобны как эпоксидные (аралдит, эпон), так и акриловые (ловикрил К4М, уайт LR) смолы.

Эпоксидные смолы не смешиваются с водой, поэтому после фиксации образцы ткани должны быть дегидратированы. Эти смолы полимеризуются при нагревании. Если иммуномечению подлежат термолабильные пептиды, то полимеризацию можно проводить в течение нескольких суток при температуре 37 С, а не при 60 С в течение ночи; иногда полимеризацию осуществляют в УФ-свете при комнатной температуре или 4 °С (заметим, что при фиксации осмием последний способ непригоден). Заливка в эпоксидные смолы проводится обычным способом, как при любом электронно-микроскопическом исследовании. Чтобы предотвратить экстракцию антигенов, нужно сократить до минимума время дегидратации и импрегнации ткани.

Смола уайт LR немного смешивается с водой, поэтому ткани можно дегидратировать в 70% спирте, что уменьшает вероятность экстракции пептидных антигенов. Эта смола полимеризуется при нагревании и в нее удобно заключать ткани, фиксированные осмием. Проведя полимеризацию не до конца, получают более мягкие, чем обычно, блоки; они легче режутся, а срезы лучше окрашиваются. Подробнее эти вопросы рассматриваются в работе, Еще более предпочтительна смола ловикрил К4М, поскольку она может полимеризоваться при весьма низкой температуре (-30 °С) и очень быстро полимеризуется при 4 С и при комнатной температуре. Однако полимеризация ловикрила в УФ-свете исключает фиксацию осмием. Процедура заливки описана в работе, а также в инструкциях, прилагаемых к препарату.

Как эпоксидные, так и акриловые смолы можно использовать для приготовления полутонких (0,3-1 мкм) срезов. Их исследуют под световым микроскопом или проводят иммуноцитохимию с использованием световой микроскопии и сравнивают с результатами, полученными для ультратонких срезов, помещенных на сеточки. Перед иммуноокрашиванием таких полутонких срезов из них нужно удалить эпоксидные смолы, например с помощью спиртового раствора гидроксида натрия. Срезы, заключенные в акриловые смолы, можно окрашивать сразу, но поскольку эти смолы гидрофильны (особенно уайт LR), в их присутствии срезы могут отлипать от стекол при окрашивании. Чтобы этого не произошло, следует использовать стекла, покрытые силиконом. Для других смол подходят стекла, покрытые поли-L-лизином. Предметные стекла с полутонкими срезами следует в течение нескольких часов подсушить на столике с подогревом (37-40 С) или оставить на ночь при 37 С, Пересушивание может привести к утрате антигенных свойств некоторыми пептидами.

Удаление эпоксидной смолы из помещенных на стекло полутонких срезов:

1. Готовят насыщенный раствор гидроксида натрия или калия в 100% спирте. Периодически встряхивают смесь несколько суток, пока раствор не станет желтовато-коричневым. Этот раствор можно использовать многократно, даже когда он станет темно-коричневым.
2. Погружают стекла в раствор на 15-40 мин в зависимости от свежести раствора.

4. Помещают срезы в 70% спирт, а затем в воду. Для иммуноокрашивания годится любой метод.
Окрашивают срез толщиной 1 мкм толуидиновым синим и убеждаются, что на срезе присутствует нужная структура. Затем готовят ультратонкие срезы (60—100 нм), которые в отраженном свете имеют цвет от золотистого до серого. Помешают срезы на чистые, не покрытые пленкой никелевые или золотые сеточки (200-300 меш) и оставляют на ночь. Срезы могут храниться на таких сеточках закрытыми неограниченно долго.

Выбор блока. Подбирают удобный для ультратонких срезов режим контрастирования. Если это нужно, окрашивают сначала полутонкие срезы, чтобы убедиться в сохранности антигена после фиксации и в активности антител. Врочем, этот тест нельзя считать надежным, поскольку метка может обнаруживаться на ультратонких срезах, но не детектироваться на полутонких. Одна из причин такого несоответствия состоит в том, что многие иммуноцитохимические методы с применением световой микроскопии не обладают достаточной чувствительностью для выявления малых количеств иммунореактивных гранул. Вместо этого можно использовать электронную микроскопию препаратов, меченных коллоидным золотом.

Иммуномечение. Процедуры, использующиеся в электронно-микроскопической иммуноцитохимии, аналогичны таковым в случае иммуноцитохимии с использованием светового микроскопа.

Оборудование:
• Пинцеты для сеточек (они не должны намагничиваться и смачиваться).
• Парафиновая пластинка (например, парафин, залитый в чашку Петри) или полоски парафилма для нанесения буфера и других реактивов, в которых должны плавать сеточки.
• Планшет Терасаки с большим числом ячеек на 15 мкл.
• Миллипоровые фильтры с диаметром пор 0,45 мкм и шприцы.

- Читать далее "Разведение антител в иммуноцитохимии. Хранение и использование антител"