Удаление пигмента с препаратов. Улучшение качества препаратов

Основное требование, предъявляемое к методу удаления тканевых пигментов, состоит в том, что он не должен влиять на антигенные свойства ткани. Это сужает круг применимых методов, но некоторые пигменты все-таки удается удалить.

Формалиновый пигмент. В этом случае ткань обычно погружают в спиртовый раствор пикриновой кислоты на 10 мин, а затем промывают водой. Эту процедуру иногда проводят до иммуноокрашивания, хотя она может отрицательно сказаться на антигенных свойствах ткани. Удаление формалинового пигмента происходит и в процессе применения иммунопероксидазного метода блокирования эндогенной пероксидазы, при этом никаких дополнительных операций не требуется.

«Ртутный» пигмент. Этот пигмент удаляют либо до иммуноокрашивания, либо во время иммунопероксидазного окрашивания перед контрастированием препаратов. Для этого их погружают на 5 мин в спиртовый раствор иода, а затем обесцвечивают 5% тиосульфатом натрия.

Меланин. Отложения меланина можно удалить погружением препаратов на 5 мин в 0,25% перманганат калия с последующим их обесцвечиванием 2% щавелевой кислотой. Поскольку эта процедура может негативно повлиять на некоторые антигены, нужно проводить контрольное окрашивание ткани, заведомо позитивной по данному антигену. Кроме того, может ухудшаться сцепление срезов со стеклом, поэтому желательно использовать адгезивы.

Альтернативный субстрат. Большинство пигментов имеют темно-коричневый цвет и их легко спутать, например, с ДАБ. Поэтому в системах с ПХ лучше использовать другие субстраты или альтернативные метки, например щелочную фосфатазу.

удаление пигментов с препаратов

Сравнение с отрицательным контролем. Пигменты выявляют на отрицательном контрольном срезе, полученном от того же блока ткани, что и анализируемые срезы. И хотя проведение такого контрольного эксперимента довольно трудоемко, оно позволяет различить пигмент и продукт иммуноцитохимической реакции.
Гистохимическое выявление пигмента. В некоторых случаях пигмент можно обнаружить с помощью гистохимического метода контрастного окрашивания пигмента.
На наш взгляд из всех перечисленных приемов наиболее приемлемо использование альтернативного субстрата.

Проницаемость тканей для антител повышается, если добавить в буферные растворы или в растворы, содержащие антитела, такие детергенты, как тритон-100 или твин-80.
Срезы. Более качественное окрашивание наблюдается на тонких срезах, полученных от небольших, хорошо зафиксированных блоков.

Повторное наслаивание. Интенсивность окрашивания при использовании ПАП и ЩФАЩФ значительно повышается после повторной инкубации реагента-мостика с комплексом фермент—антитело. Было показано также, что качество окрашивания улучшается при повторном наслаивании первого антитела и повторной инкубации с ним препаратов после промывания их в буфере.

Комбинация методов. Помимо описанных выше физических методов, улучшающих качество окрашивания, для выявления одного антигена можно использовать разные системы иммуноокрашивания.
Двойное и тройное окрашивание. Два и более антигенов в одном мазке или срезе можно выявить несколькими способами.

Последовательное окрашивание. Срез или мазок окрашивают, чтобы выявить один из антигенов, и фотографируют. Затем до наслаивания второго антитела, связывающегося с другим антигеном, элюируют комплекс антиген—антитело или обесцвечивают субстрат с помошью перманга-ната калия.

Одновременное окрашивание

Наиболее эффективный вариант метода двойного окрашивания — выявление и визуализация двух и более антигенов одновременно. При этом используют два подхода:
а) наслаивают на препарат одно антитело и используют систему детекции, выявляющую соответствующую метку, а затем проводят аналогичные операции со вторым антигеном;
б) если используются антитела от разных видов, смешивают обе партии реагентов и проводят окрашивание в один прием.

При этом можно использовать:
• две или три флуоресцентных метки, как правило, готовые конъюгаты антител;
• одну ферментную метку для выявления двух антигенов, каждый из которых визуализируют с помощью своего субстрата;
• две ферментные метки;
• комбинацию фермент—иммуноглобулины, меченные золотом, с усилением окраски серебром.

Важно, чтобы разные компоненты используемой системы не давали перекреста. Лучше всего, если антитела происходят от разных видов и компоненты двух систем иммуноокрашивания не реагируют между собой. Можно использовать и два первых антитела от одного и того же вида, но при этом следует иметь в виду, что на втором этапе реагент-мостик может связаться с любым первым антителом, не прореагировавшим на первом этапе, что даст ложноположительный результат.

Следует позаботиться и о выборе субстрата с тем, чтобы получить хороший контраст при окраске продуктов. В зависимости от исследуемых антигенов можно при необходимости разводить антитела так, чтобы окрашивание было сбалансированным, лишь бы одна реакция не маскировала другую.

Несмотря на то, что последовательное окрашивание требует больше времени, мы предпочитаем именно этот метод, используя две разные ферментные метки независимо от источника антител. При наличии адекватного контроля перекрестных реакций можно использовать первые антитела от одного вида.

В последнее время в иммуноцитохимии достигнуты значительные успехи. Улучшилось качество реактивов, а фирмы-производители стали давать подробные инструкции по их применению. Все это помогло решить некоторые проблемы, ранее возникавшие при проведении иммуноцитохимических анализов. Однако ряд проблем все-таки осталось, и связано это с
• плохой морфологией препаратов;
• плохим окрашиванием;
• наличием фонового окрашивания.

- Вернуться в оглавление раздела "Генетика."

Оглавление темы "Молекулярная диагностика. Иммуноцитохимия":
1. Молекулярная клиническая диагностика. История молекулярной клинической диагностики
2. Фенотипирование. Генотипирование
3. Анализ экстрактов тканей. Методы молекулярной диагностики тканей
4. Перспективы молекулярной диагностики. Золото в иммуноцитохимии
5. Контроль в иммуноцитохимии. Контроль реактивов и тканей
6. Лабораторный стол в иммуноцитохимии. Подготовка к окрашиванию и реагенты
7. Работа с препаратами в иммуноцитохимии. Специальные методы окрашивания
8. Проблема нехватки материала в иммуноцитохимии. Автоматизация в иммуноцитохимии
9. Иммуноокращивание. Методы улучшения иммуноокрашивания
10. Удаление пигмента с препаратов. Улучшение качества препаратов

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: