Иммуноокращивание. Методы улучшения иммуноокрашивания

Увеличивая время инкубации препаратов с первыми антителами или со вторыми реагентами, можно значительно повысить интенсивность окраски. В большинстве случаев рекомендуется инкубировать препараты 30-60 мин, но увеличение этого времени вдвое может дать очень хороший эффект. Как правило, рекомендуемое время инкубации нужно рассматривать как минимальное, но не как оптимальное или предельное.

Инкубацию с первыми антителами можно проводить в течение нескольких часов, а при слабом выявлении антигенов оставлять препараты в инкубационной камере на ночь (при 4 С, чтобы уменьшить испарение). При продолжительной инкубации иногда происходит отлипание срезов и подсыхание препаратов. Чтобы избежать этого, стекла помещают в камеру при достаточно высокой влажности в горизонтальном положении.

В большинстве случаев инкубацию препаратов с антисывороткой проводят при комнатной температуре (20—22 °С). Для повышения качества окрашивания иногда иммунологические реагенты подогревают и проводят инкубацию при более высокой температуре. При этом следует быть уверенным, что не происходят денатурация антител, потеря антигенов и деструкция ткани. Мы получали хорошие результаты при температуре 37 С, однако имеются данные об успешной инкубации при температурах вплоть до 60 С.

Для хорошей воспроизводимости результатов необходимо предварительно прогревать инкубационную камеру и реактивы. В последнее время для этого используют микроволновую печь, что позволяет уменьшить время инкубации с широким кругом антител до 30с.

иммуноокрашивание в медицине

Результат окрашивания в значительной степени зависит от концентрации первых антител и других иммунологических реактивов. Используя более концентрированные растворы, можно усилить интенсивность окраски, однако следует помнить о том, что при этом может повыситься фон.

Положительный эффект нагревания во время инкубации препаратов, по-видимому, обусловливается увеличением скорости хаотического движения молекул антител, что повышает вероятность связывания их с антигенами. Аналогичный результат могло бы дать и встряхивание препаратов во время инкубации. Когда стекла лежат в инкубационной камере горизонтально, сделать это довольно трудно. Встряхивание применяется в некоторых автоматизированных системах и в тех случаях, когда окрашивание проводится в контейнерах.

Антитела могут неспецифически связываться с реагентами, присутствующими на срезах, или заряженными группами. Такие нежелательные взаимодействия блокируют с помощью белковых препаратов, например неиммунной сыворотки, бычьего сывороточного альбумина (БСА) или сыворотки плода коровы (СПК), добавляя их к разведенным антителам или нанося на препараты до инкубации последних с антисывороткой.

Кроме того, неспецифическое окрашивание может возникать из-за присутствия в антисыворотке посторонних антител, которые можно удалить абсорбцией на измельченных или гомогенизированных экстрактах таких органов, как мозг или печень.
Антитела могут связываться и со свободными альдегидными группами. Такое неспецифическое связывание частично устраняют с помощью раствора боргидрида натрия.

В клетках, мазках или на тканевых срезах могут присутствовать пигменты, искажающие результаты ИЦХ. Иногда возникают проблемы, обусловленные осаждением на препаратах желчи, солей железа, липофусцина, углекислоты и меланина после обработки тканей фиксаторами на основе формалина или хлорида ртути.

- Читать далее "Удаление пигмента с препаратов. Улучшение качества препаратов"

Оглавление темы "Молекулярная диагностика. Иммуноцитохимия":
1. Молекулярная клиническая диагностика. История молекулярной клинической диагностики
2. Фенотипирование. Генотипирование
3. Анализ экстрактов тканей. Методы молекулярной диагностики тканей
4. Перспективы молекулярной диагностики. Золото в иммуноцитохимии
5. Контроль в иммуноцитохимии. Контроль реактивов и тканей
6. Лабораторный стол в иммуноцитохимии. Подготовка к окрашиванию и реагенты
7. Работа с препаратами в иммуноцитохимии. Специальные методы окрашивания
8. Проблема нехватки материала в иммуноцитохимии. Автоматизация в иммуноцитохимии
9. Иммуноокращивание. Методы улучшения иммуноокрашивания
10. Удаление пигмента с препаратов. Улучшение качества препаратов

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: