Работа с препаратами в иммуноцитохимии. Специальные методы окрашивания

Убедитесь, что для окрашивания взято такое число стекол, с которым удобно работать. Новый метод лучше осваивать на небольшом числе препаратов и тщательно выполнять сами операции. В таком случае, если вас постигнет неудача, пропадет не слишком много реактивов и стекол. В дальнейшем для повышения эффективности работы можно обрабатывать большие партии препаратов. Несмотря на то, что время обработки каждого препарата тем или иным реактивом остается прежним независимо от числа окрашиваемых препаратов, время, необходимое для завершения всей процедуры иммуноокрашивания, с увеличением этого числа возрастает. Можно уменьшить число стекол, помещая на одно стекло два или три среза (в зависимости от их размера). Отдельные срезы лучше обвести восковым карандашом. Это полезно делать и тогда, когда на стекле находится только один срез: вы сможете наносить реактивы локально и сэкономите дорогостоящие антитела. Небольшие срезы удобно помещать на специальные планшеты с ячейками.

Однако если парафиновые срезы предполагается обрабатывать протеолитическими ферментами, следует наносить на одно стекло только те срезы, для которых режим протеолиза одинаков. Промывание и инкубацию препаратов с протеолитическими ферментами, а также блокирующие процедуры можно проводить в сосудах Коплина или в других емкостях объемом 200 мл. При окрашивании больших партий горизонтально расположенных стекол иммунопероксидазным методом с использованием в качестве субстрата ДАБ/Н2О2 это позволит уменьшить преципитацию на срезах. Инкубацию препаратов с субстратами для щелочной фосфатазы можно проводить в специальных ванночках, но это довольно дорого. Лучше отфильтровывать небольшие объемы реактивов прямо на предметные стекла, лежащие в инкубационной камере.

Чтобы срезы не отлипали, все процедуры следует проводить с осторожностью. Промывая стекла, нельзя сильно встряхивать их и направлять струю буфера на срез. Не следует наносить реагенты на срезы или мазки каплями с помощью пипетки, лучше аккуратно наслаивать их.

иммуноцитохимия

Во время инкубации препаратов с антителами и другими компонентами системы иммуномечения стекла нужно помещать в закрытую камеру горизонтально. При нанесении на препараты иммунологических реагентов важно удалять со стекла излишки буфера, которые могут уменьшить титр антител и ослабить окраску, однако во время окрашивания срезы не должны высыхать.
С учетом всего этого на каждый препарат лучше наносить не более 50—100 мкл разведенной антисыворотки.

Если в одном и том же режиме регулярно окрашивают большие партии препаратов, то для экономии реактивов лучше иметь контейнеры с разведенной антисывороткой, куда погружают стекла в штативе. Мы с успехом применяли такой способ для окрашивания препаратов с помощью ЩФАЩФ, пользуясь одними и теми же партиями реактивов несколько месяцев. В промежутках между экспериментами контейнеры с растворами лучше хранить в холодильнике, добавив в них азид натрия для предотвращения роста микроорганизмов.

Контрастирование проводят для облегчения локализации антигенов в тканях. Чаще всего в качестве контрастирующего вещества применяют гематоксилин. В тех случаях, когда субстрат дает спирторастворимый продукт, следует использовать водный раствор гематоксилина, например гематоксилин Мейера. Если продукт имеет синюю окраску, можно использовать метиленовый зеленый или нейтральный красный, хотя они не очень эффективны для водной иммерсии.
Контрастирующие агенты, среди которых наиболее широко применяется синий Эванса, можно применять вместе с флуоресцентной меткой.

Иногда на одних и тех же срезах проводят гистохимические реакции или дополнительно окрашивают их более сложными красителями, например трихромами. Такие методы должны давать контрастную окраску по сравнению с иммуноокрашиванием; кроме того, их можно применять, только если последовательные процедуры не сказываются отрицательно одна на другой.

- Читать далее "Проблема нехватки материала в иммуноцитохимии. Автоматизация в иммуноцитохимии"

Оглавление темы "Молекулярная диагностика. Иммуноцитохимия":
1. Молекулярная клиническая диагностика. История молекулярной клинической диагностики
2. Фенотипирование. Генотипирование
3. Анализ экстрактов тканей. Методы молекулярной диагностики тканей
4. Перспективы молекулярной диагностики. Золото в иммуноцитохимии
5. Контроль в иммуноцитохимии. Контроль реактивов и тканей
6. Лабораторный стол в иммуноцитохимии. Подготовка к окрашиванию и реагенты
7. Работа с препаратами в иммуноцитохимии. Специальные методы окрашивания
8. Проблема нехватки материала в иммуноцитохимии. Автоматизация в иммуноцитохимии
9. Иммуноокращивание. Методы улучшения иммуноокрашивания
10. Удаление пигмента с препаратов. Улучшение качества препаратов

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: