Для каждого иммуноцитохимического теста необходимо провести параллельный контрольный эксперимент. Следует убедиться в том, что отрицательный результат обусловлен именно отсутствием конкретного антигена, а не методическими ошибками. Аналогично, положительный результат должен быть обусловлен специфическим связыванием антитела, а не какими-то другими причинами. Поэтому в контроле нуждаются реагенты, ткани и все процедуры.

Антитела, имеющиеся сейчас в продаже, имеют гораздо большую специфичность, чем препараты, выпускавшиеся ранее, и качество антител, предназначенных для диагностических целей, проверяется еще в процессе их производства. Поэтому при работе с новым препаратом антител остается только подобрать его оптимальную рабочую концентрацию, а также выбрать режим протеолиза на фиксированных и заключенных в среду срезах. Кроме того, нужно проверить ткани на неспецифическое окрашивание, не выявляющее соответствующий антиген. Дополнительный контроль абсорбции нужен только в том случае, если наблюдается перекрестное взаимодействие реагентов.

Если спустя какое-то время происходит снижение качества окрашивания данной партией препарата антитела, нужно еще раз проверить препарат, как это описано выше, и, возможно, подобрать новые условия работы с ним.

Контроль процедур позволяет убедиться в правильности выполнения всех операций и в том, что реактивы не потеряли своей активности. Рассмотрим более подробно все аспекты этого контроля,

Нужно убедиться, что используемое антитело сохраняет свою активность, поэтому каждый препарат первого антитела, используемый для окрашивания, проверяют на срезе ткани, заведомо содержащей интересующий нас антиген. Контрольный срез фиксируют и обрабатывают точно так же, как экспериментальный, и окрашивают его таким же способом, как исследуемые срезы. В случае положительного контроля используют ткани с низким или средним, но не с аномально высоким содержанием антигена. Это позволяет оценить чувствительность используемого метода. Если после окрашивания и тест, и контроль дают отрицательный результат, можно сделать вывод, что какие-то операции выполнены неправильно и необходима перепроверка. В некоторых случаях желательно провести отрицательный тканевой контроль, т. е. окрасить срез ткани, которая заведомо не содержит данного антигена, но обработана точно так же, как исследуемые срезы. Если контрольный срез окрашивается, то необходимо выяснить, почему. Обычно такой контроль не требуется, поскольку для достоверной оценки качества выбранных реактивов достаточно положительного контроля.

Для многих антигенов можно не проводить даже положительный тканевой контроль. Так, общий лейкоцитарный антиген, антиген, связанный с фактором VIII, виментин и другие антигены присутствуют во всех тканях и поэтому служат внутренним контролем для соответствующих им антител. Однако в тех лабораториях, где не окрашивают большие партии препаратов и антитела используются нерегулярно, положительный контроль необходим. Поддержанию высоких стандартов способствует постоянное участие лабораторий в Национальных программах гарантии качества.

Активность первых антител можно контролировать, заменив их неиммунным реактивом при обработке параллельных (контрольных) срезов. Существует несколько вариантов такой замены:
а) замена первыми антителами, которые были абсорбированы соответствующими очищенными антигенами;
б) замена посторонними («нейтральными») антителами;
в) замена неиммунной сывороткой, полученной от того же донора, что и первые антитела;
г) первые антитела вообще не используют.

Первый вариант замены наиболее специфичен, но вследствие дороговизны очищенного антигена используется при рутинных исследованиях довольно редко. Второй вариант часто применяют в виде панели реактивов для диагностики. Третий и четвертый варианты при необходимости можно объединить. Для точности сравнения при выполнении операций (б) и (в) используют одинаковые концентрации иммуноглобулина и первого антитела.

На сегодняшний день контроль реагентов, использующихся на втором и третьем этапах ИЦХ-анализа, обычно не требуется. Если наблюдается неспецифическое окрашивание, не обусловленное качеством первых антител, то можно провести серию тестов с заменой неиммунными реагентами.

- Читать далее "Лабораторный стол в иммуноцитохимии. Подготовка к окрашиванию и реагенты"