Перспективы молекулярной диагностики. Золото в иммуноцитохимии

Практически все методы анализа нуклеиновых кислот, применявшиеся примерно до 1982 г., основывались на использовании изотопно меченных зондов. Однако в последние 15 лет появилось множество нерадиоактивных меток — таких как биотин, дигоксигенин, флуорохромы, биолюминесцентные и хемилюминесцентные вещества. Эти метки не обеспечивают столь высокой чувствительности, как изотопные, но обладают тем преимуществом, что их можно широко использовать в клинических лабораториях, не подвергаясь риску радиоактивного облучения. По-видимому, к концу века нерадиоактивные методы анализа в диагностических лабораториях станут рутинными.

Методы гено- и фенотипирования интактных клеток и клеточных экстрактов разрабатывались практически независимо, однако в настоящее время — в основном благодаря появлению метода ПЦР — у них появляется все больше точек соприкосновения. Теоретически ПЦР дает возможность амплифицировать уникальный ген в интактной клетке до такой степени, что его удается визуализировать и идентифицировать в специфических клетках с помощью гибридизации с меченым зондом. Однако здесь возникает ряд проблем. Прежде всего при проведении ПЦР in situ большая часть продуктов амплификации выходит из клетки.

Возможно, эту проблему удастся решить, несколько изменив метод амплификации или приняв меры к сохранению ДНК в клетке. Есть надежда, что, объединяя все методы молекулярной клинической диагностики, мы сможем когда-нибудь идентифицировать нужный нам ген и его продукты среди огромного множества мРНК, белков и генов, присутствующих в одной клетке.

Золото в иммуноцитохимии

Частицы коллоидного золота стали использовать в качестве метки в иммуноцитохимии сравнительно недавно. Метод. который вначале применялся преимущественно для приготовления электронно-микроскопических препаратов в сугубо научных целях, получил распространение в целом ряде диагностических лабораторий. В своем первоначальном варианте он не обладал достаточной чувствительностью для визуализации тканевых антигенов. Чтобы увеличить чувствительность, срезы или клетки инкубировали в коллоидном растворе серебра, содержащем частицы меченого золота, которые служили центрами осаждения серебра.

При таком способе окрашивания получается стабильный продукт черного цвета. Этот высокочувствительный метод можно рекомендовать для детекции антигенов в тканях, фиксированных формалином и заключенных в парафин, где антигены не выявляются с помощью иммуноферментных методов. Чувствительность можно еще более повысить, используя световой поляризационный микроскоп. Благодаря высокой интенсивности окрашивания этот метод можно сочетать с другими методами, например с окрашиванием трихромами, а также использовать в морфометрии с помощью автоматических анализаторов изображения. Он пригоден также для двойного мечения.

Несмотря на очевидные преимущества, метод с меченными золотом, окрашенными серебром антителами не нашел пока широкого применения в молекулярной клинической диагностике. Дело в том, что это весьма капризная методика, необычайно чувствительная к температуре и времени экспозиции препаратов в усиливающем растворе. Кроме того, метод «не по карману» большинству лабораторий из-за дороговизны реактивов.
Каждый из рассмотренных методов имеет свои преимущества и недостатки, так что никакого универсального метода, пригодного во всех случаях, не существует.

молекулярная диагностика

Метод с использованием поликлональной кроличьей антисыворотки и конъюгированного с ПХ авидин-биотинового комплекса.

1. Только для парафиновых срезов. Блокируют эндогенную пероксидазу либо 0,6% H2O2 в 80% метаноле в течение 20 мин, либо 3% Н2О2 в дистиллированной воде в течение 10 мин.
2. Тщательно промывают препараты сначала в проточной водопроводной воде, затем в дистиллированной воде и в ТСБ.
3. Инкубируют препараты 15 мин в 20% нормальной свиной сыворотке (НСС), растворенной в ТСБ.
4. Удаляют со стекол излишки буфера с сывороткой, наносят препарат первого антитела, разведенного в 20% НСС в ТСБ, инкубируют 30 мин.

5. Промывают препараты в двух сменах ТСБ, по 10 мин в каждой.
6. Удаляют излишки буфера, наносят связанные с биотином свиные антитела к кроличьему иммуноглобулину (например, Dako E353, UK), разведенные в ТСБ, и инкубируют препараты 30 мин.
7. Промывают препараты в двух сменах ТСБ, по 10 мин в каждой.
8. Удаляют излишки буфера, наносят на препараты конъюгат ПХ с АВС2) (например, Dako K355) и инкубируют 30 мин.

9. Промывают препараты в двух сменах ТСБ, по 10 мин в каждой.
10. Инкубируют срезы 3-5 мин в Н2О2/0,05% ДАБ в ТСБ (или в других субстратах).
11. Тщательно промывают препараты в проточной воде.
12. Контрастируют препараты гематоксилином и при необходимости промывают их в проточной воде по Скотту до появления синей окраски.
13. Высушивают и заключают в среду DPX.

ЩФАЩФ-метод с использованием моноклональных антител мыши

В этом методе препараты дополнительно обрабатывают в соответствии с пп. 7—10. Для повышения чувствительности метода желательно повторить эти процедуры один или два раза.
1. Наносят на препараты первое антитело, растворенное в ТСБ, инкубируют при комнатной температуре 25 мин.
2. Промывают по 5 мин в двух сменах ТСБ.
3. Наносят на препараты кроличьи антитела к иммуноглобулину мыши (например, Dako Z259), разведенные в ТСБ, инкубируют 25 мин.

4. Промывают 2 мин в ТСБ.
5. Наносят на препараты комплекс ЩФАШФ, растворенный в ТСБ, инкубируют 25 мин.
6. Промывают 2 мин в ТСБ.
7. Наносят на препараты кроличьи антитела к иммуноглобулину мыши, инкубируют 10 мин.

8. Промывают 2 мин в ТСБ.
9. Наносят на препараты комплекс ЩФАЩФ, инкубируют 10 мин.
10. Промывают 2 мин в ТСБ.
11.Инкубируют препараты 10-15 мин в свежеприготовленном растворе субстрата.

12. Промывают препараты сначала в буфере, а затем в дистиллированной воде.
13. Контрастируют препараты гематоксилином и при необходимости промывают их в проточной воде по Скотту до появления синей окраски.
14. Заключают препараты в водную среду.

Непрямой трехэтапный иммунопероксидазный метод с использованием моноклональных первых антител мыши

1. Только для парафиновых срезов. Блокируют активность эндогенной пероксидазы 0,6% Н2О2 в 80% метаноле в течение 20 мин либо 3% Н2О2 в дистиллированной воде в течение 10 мин.
2. Тщательно промывают препараты сначала в проточной водопроводной, а затем в дистиллированной воде.
3. Промывают препараты в ТСБ, рН 7,6.
4. Удаляют со стекол излишки буфера и наносят первое антитело, разведенное в ТСБ, инкубируют 30 мин.

5. Промывают препараты в трех сменах ТСБ, по 5 мин в каждой.
6. Удаляют излишки буфера и наносят на препараты конъюгат ПХ с кроличьими антителами к иммуноглобулину мыши (например, Dako P260), инкубируют 30 мин.
7. Промывают препараты в трех сменах ТСБ, по 5 мин в каждой.
8. Удаляют излишки буфера и наносят на препараты конъюгат ПХ со свиными антителами к кроличьему иммуноглобулину (например, Dako P217), инкубируют 30 мин.

9. Промывают препараты в трех сменах ТСБ, по 5 мин в каждой. 10. Инкубируют срезы в растворе ДАБ/Н2О2 или в другом субстрате (см. протокол 2.6) до 5 мин.
11.Тщательно промывают в проточной воде.
12. Контрастируют гематоксилином и, если требуется, дифференцируют окраску.
13. Обезвоживают препараты в батарее спиртов, затем в ксилоле и заключают их в DPX.

- Читать далее "Контроль в иммуноцитохимии. Контроль реактивов и тканей"

Оглавление темы "Молекулярная диагностика. Иммуноцитохимия":
1. Молекулярная клиническая диагностика. История молекулярной клинической диагностики
2. Фенотипирование. Генотипирование
3. Анализ экстрактов тканей. Методы молекулярной диагностики тканей
4. Перспективы молекулярной диагностики. Золото в иммуноцитохимии
5. Контроль в иммуноцитохимии. Контроль реактивов и тканей
6. Лабораторный стол в иммуноцитохимии. Подготовка к окрашиванию и реагенты
7. Работа с препаратами в иммуноцитохимии. Специальные методы окрашивания
8. Проблема нехватки материала в иммуноцитохимии. Автоматизация в иммуноцитохимии
9. Иммуноокращивание. Методы улучшения иммуноокрашивания
10. Удаление пигмента с препаратов. Улучшение качества препаратов

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: