Фенотипирование. Генотипирование

Определить фенотип клеток — как циркулирующих в крови, так и входящих в состав сложной ткани — не составляет особого труда. Чаще всего при этом используют подход, основанный на способности клеток связывать специфические антитела. Существует много различных иммуноцитохимических методов, но все они преследуют одну цель — выявление в ткани тех или иных полипептидов. Получаемые данные позволяют исследовать процессы дифференцировки клеток, что особенно важно для прогнозирования развития лимфом, лейкозов и сблидных опухолей.

За последнее десятилетие получено много важных с диагностической точки зрения антител; многие из них имеются в продаже. Сегодня в принципе можно получить антитела к любому белку. Можно также исследовать функцию генов, клонированных с помощью методов обратной генетики; для этого синтезируют пептиды, кодируемые данной последовательностью, получают антитела к ним и используют эти антитела для фенотипирования тканей, Если такие пептиды пришить к молекулам большого размера, то они будут обладать достаточной иммуногенностью для получения моноклональных и поликлональных антител.

Чаще при этом используют моноклональные антитела, но поликлональные антитела обладают рядом преимуществ (если не считать того, что их нельзя получать в неограниченном количестве): они направлены против большого числа эпитопов, имеют более высокую константу связывания и соответственно обеспечивают большую чувствительность. Фенотипирование проводят с помощью как световой, так и электронной микроскопии. Для визуализации полипептидов в клетках в обоих случаях используют меченые антитела. При световой микроскопии метками служат ферменты или флуорохромы, а при электронной микроскопии — электроноплотные маркеры.

фенотипирование в медицине

Для выявления в интактных клетках экзогенных и эндогенных нуклеиновых кислот используют гибридизацию in situ. Таким способом легко определить набор хромосом в клетках как взрослого организма, так и плода. Исследуя in situ клетки амниотической жидкости или ворсинки хориона, устанавливают пол плода, что очень важно для пренатальной диагностики заболеваний, сцепленных с полом. Эти же клетки можно использовать для выявления трисомии, лежащей в основе синдрома Дауна. Определяя кариотип клеток, пытаются исследовать патогенез опухолей. Гибридизация in situ с геномными или РНК-зондами позволила лучше понять особенности дифференцировки специфических клеток и их роль в развитии патологий.

Гибридизация in situ все шире используется для диагностики вирусных и других инфекционных заболеваний. Большой интерес, в частности, вызывает вирус папилломы человека (HPV), предположительно играющий роль в развитии рака шейки матки. Уже разработаны и повсеместно используются для диагностики заболеваний шейки матки методы обнаружения этого вируса. Аналогичным образом, легко идентифицируются цитомегаловирус, вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), вирус Эпштейна— Барр (EBV). С помощью гибридизации in situ и техники полимеразной цепной реакции (ПЦР) можно диагностировать и невирусные инфекционные заболевания, например часто возникающую у больных СПИДом пневмонию, вызываемую Pneumocystis carinii.

В принципе же эти методы позволяют идентифицировать любую инфекцию. В будущем появится возможность типировать бактерии и вирусы, а также определить генетические детерминанты их вирулентности.

Метод гибридизации in situ расширяет возможности цитогенетики, поскольку позволяет устанавливать хромосомную локализацию индивидуальных генов. Это имеет огромное значение для выяснения структурной организации хромосом, построения их физических карт, выявления сцепленных генов. Но пока молекулярная цитогенетика применяется в диагностических лабораториях не очень широко.

Интактные клетки изучают и другими методами — такими, как проточная цитометрия или определение числа районов ядрышкового организатора (ЯОР). Проточная цитометрия используется для фенотипирования и предварительного генотипирования клеток и применяется в основном для определения подтипов лимфоцитов и плоидности опухолевых клеток. Последнее имеет прогностическое значение при некоторых опухолях. ЯОР выявляются при простом окрашивании серебром. Определение их числа дает информацию о биологии опухолей и имеет определенное диагностическое значение, однако не позволяет четко отличать доброкачественные опухоли от злокачественных.

Оглавление темы "Молекулярная диагностика. Иммуноцитохимия":
1. Молекулярная клиническая диагностика. История молекулярной клинической диагностики
2. Фенотипирование. Генотипирование
3. Анализ экстрактов тканей. Методы молекулярной диагностики тканей
4. Перспективы молекулярной диагностики. Золото в иммуноцитохимии
5. Контроль в иммуноцитохимии. Контроль реактивов и тканей
6. Лабораторный стол в иммуноцитохимии. Подготовка к окрашиванию и реагенты
7. Работа с препаратами в иммуноцитохимии. Специальные методы окрашивания
8. Проблема нехватки материала в иммуноцитохимии. Автоматизация в иммуноцитохимии
9. Иммуноокращивание. Методы улучшения иммуноокрашивания
10. Удаление пигмента с препаратов. Улучшение качества препаратов

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: