Анализ кариотипа человека. Цитогенетический метод анализа хромосом человека.

Анализ кариотипа человека проводят в культуре делящихся соматических и половых клеток. Наиболее часто при цитогенетических исследованиях в медицинской генетике используют культуру клеток периферической крови, прежде всего лимфоцитов, костного мозга и фибробластов. Наиболее доступны для исследований лимфоциты периферической крови, которые, в большинстве случаев и служат объектом цитогенетического анализа у человека в постнатальном периоде. Для анализа кариотипа плода могут быть использованы различные клеточные культуры; их выбор диктуется сроком беременности, в котором проводится исследование. Так, на раннем сроке (до 12 недель внутриутробного развития) анализ хромосом целесообразно проводить в клетках ворсин хориона, в то время как в более позднем сроке цитогенетическому исследованию подвергают клетки плода, выделенные из амниотической жидкости, пуповинной крови и плаценты.

Для исследования кариотипа человека достаточно получить образец периферической крови в количестве 1-2 мл. Цитогенетический анализ включает три основных этапа: 1) культивирование клеток; 2) окраску препарата; 3) микроскопический анализ препарата. Культивирование клеток проводится следующим образом. После забора образец крови помещают в питательную солевую среду с добавлением цельной сыворотки крупного рогатого скота и белка бобовых растений — фитогемагглютинина, стимулирующего процесс деления клеток.

Успех цитогенетического исследования в значительной мере определяется тем, сколько клеток в культуре будут находиться в стадии метафазы. Для увеличения количества метафазных клеток за полтора часа до окончания культивирования в культуру вводят колхицин, который разрушает клеточное веретено, приостанавливает деление клеток на стадии метафазы и увеличивает конденсацию хромосом. Обычно, продолжительность культивирования составляет 72 ч. После его окончания клетки с питательной средой центрифугируют и помещают в гипотонический раствор хлорида калия или цитрата натрия. Гипотоническая обработка приводит к разрыву ядерной оболочки и межхромосомных связей и свободному перемещению хромосом в цитоплазме. После этого производится фиксация клеток смесью метанола и уксусной кислоты в соотношении 3:1, после чего клеточную суспензию раскапывают на охлажденные влажные предметные стекла и высушивают на воздухе.

На следующем этапе цитогенетического исследования производится окраска препаратов. В зависимости от целей исследования, то есть оттого, какой именно тип перестроек необходимо выявить, можно использовать различные виды окрашивания.

кариотип человека

Наиболее простой метод окрашивания хромосом, называемый в настоящее время сплошным или рутинным, применяют для определения количества хромосом в препарате и выявления геномных мутаций и анеуплоидий. При этой окраске используют краситель Гимзы, который равномерно прокрашивает хромосомы по всей длине, что дает возможность идентифицировать хромосомы и оценить их количество в препарате. Этот метод окраски успешно применялся до 70-х годов прошлого века и позволил выявить этиологию большинства хромосомных синдромов, характеризующихся изменением количества хромосом. В настоящее время сплошное окрашивание применяют, в основном, для выявления количественных аномалий кариотипа, а также специфического сайта ломкости при синдроме фрагильной X-хромосомы. Препарат метафазных хромосом человека, окрашенных по всей длине, представлен на рисунке.

Однако использование рутинного метода окраски не позволяет выявлять структурные перестройки хромосом. В этих случаях применяют специальные методы, так называемой, дифференциальной окраски, в результате которой хромосомы приобретают поперечную исчерченность. Расположение и толщина темных и светлых полос строго индивидуальны для каждой хромосомы, что позволяет проводить их точную идентификацию и выявлять структурные перестройки. Для объяснения возникновения различно окрашенных полос на хромосомах выдвигается несколько гипотез: различия в количественном содержании А—Т- и G—С-пар оснований, особенности строения нуклеосом, а так же асинхрониость репликации различных участков ДНК.

Наибольшее распространение получил простой и эффективный G-метод дифференциального окрашивания. В этом случае для окрашивания хромосом также используют краситель Гимзы, однако, хромосомы предварительно обрабатывают раствором трипсина. Процедура окрашивания занимает от 5 до 10 минут и приводит к появлению специфичного для каждой хромосомы рисунка поперечной исчерченности. Показано. что количество полос в метафазных и прометафазных пластинках существенно различается: в метафазных пластинках их число достигает 400, а в прометафазных - от 800 до 1000. Препарат метафазных хромосом человека, окрашенных по G-методу, представлен на рисунке.

Другие методы окраски используются реже вследствие их сложности или узкой специфичности. R-метод обусловливает сегментацию хромосом, противоположную той, которая имеет место при окраске G-методом.

С-метод дифференциальной окраски позволяет анализировать лишь некоторые районы хромосом - участки так называемого конститутивного гетерохроматина, локализованного в околоцетромерных областях длинных плеч хромосом 1, 9 и 16, в длинном плече Y-хромосомы, а также в коротких плечах акроцентрических хромосом.

Для дифференциальной окраски хромосом могут использоваться флуорохромы: акрихин, акрихин-иприт, квинакрин и другие (Q-метод окраски). По результатам дифференциальной флуоресцентной окраски идентифицируют каждую пару гомологов, а по свечению Y-хроматина определяют наличие Y-хромосомы в интерфазном ядре.

Третий этап исследования кариотипа человека заключается в световом микроскопировании фиксированных и окрашенных препаратов метафазных хромосом. Для адекватного выявления хромосомных аномалий необходимо проанализировать не менее 30 метафазных пластинок. В том случае, если предполагается мозаицизм по хромосомным аномалиям, количество анализируемых хромосом должно быть увеличено. Число клеток (n) необходимых для анализа с целью определения заданного уровня мозаицизма можно определить по формуле биноминального распределения: Р = (1 — р)n, где р — заданный уровень мозаицизма, Р - вероятность обнаружения мозаицизма. Учитывая, что в различных клетках организма количество нормальных и аномальных клонов может различаться, для выявления мозаицизма может потребоваться анализ нескольких тканей, например, клеток крови, фибробластов, половых желез.

- Читать далее "Молекулярно-цитогенетические методы анализа кариотипа человека. Нормальный кариотип человека."

Оглавление темы "Анализ хромосом человека. Аномалии хромосом человека.":
1. Картирование наследственных заболеваний. Методы картирования наследственных заболеваний.
2. Локусы генов. Генетическое расстояние между двумя локусами.
3. Строение хромосом человека. Классификация хромосом человека.
4. Анализ кариотипа человека. Цитогенетический метод анализа хромосом человека.
5. Молекулярно-цитогенетические методы анализа кариотипа человека. Нормальный кариотип человека.
6. Биохимические методы диагностики наследственных болезней. Иммуно-гистохимический метод.
7. Молекулярно-генетические методы диагностики наследственных заболеваний.
8. Хромосомные синдромы. Классификация хромосомных аномалий у человека.
9. Межхромосомные перестройки. Реципрокные транслокации. Робертсоновские транслокации.
10. Численные аномалии хромосом. Структурные аномалии хромосом.

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: