Стратегия картирования генов человека. Методы полногеномного скрининга.

Выбор стратегии картирования гена определяется имеющейся информацией о продукте гена и/или о функции гена. Существует две основных стратегии: «прямая генетика» — основанная на принципе «от белка к гену», и «обратная генетика» — «от гена к белку» и «от нормального гена к мутантному аллелю». Естественно, что первыми были исследованы те гены человека, продукт которых был охарактеризован на уровне белка, а метод картирования, основанный на стратегии «прямой генетики» получил название функционального картирования. В большинстве случаев ни о природе конкретного гена, ни о его продукте, ни о механизме патологии , вызываемой мутацией этого гена, ничего не известно. Это привело к необходимости разработки новых подходов к картированию генов, основными из которых являются кандидатное, позиционное и позицианно-каидидатное картирование. Однако независимо от используемого подхода необходимо подтверждение ассоциации гена с данным заболеванием путем обнаружения у больных изменений нуклеотидной последовательности этого гена, отсутствующие у здоровых.

Функциональное картирование используется при известном продукте гена и включает следующие этапы: определение аминокислотной последовательности белка (или выделение мРН К) и реконструкция кДН К; синтез олигонуклеотидного зонда и скрининг кДНК-библиотек для выделения кДНК-клона; установление хромосомной локализации гена-мишени (методом гибридизации in situ или др.); скринирование контигов, охватывающих район локализации гена-мишени, для определения клонов, гибридизующихся с данным кДНК-клоном; секвенирование позитивных клонов и характеристика гена-мишени (выявление мутаций). С использованием этого подхода у человека были картированы гены гемоглобина и факторов свертывания крови.

Кандидатное картирование основано на выборе белка-кандидата, аномалии которого могут привести к симптомам изучаемого наследственного заболевания. Далее выбирают ген(ы)-кандидат(ы), исходя из данных о нуклеотидной последовательности всех клонированных генов, и вырабатывают стратегию поиска мутаций для подтверждения/опровержения ассоциации гена-кандидата и изучаемого заболевания. Данная стратегия не очень эффективна для картирования генов болезней человека, что обусловлено недостатком информации о них. С другой стороны ценность отрицательного результата определяется возможностью исключить данный ген из списка ответственных за данное заболевание. Наиболее успешно этот метод применяется при картировании генов мультифакториальных заболеваний: так были исследованы некоторые гены, продукты которых участвуют в патогенезе сосудистых заболеваний и диабета.

Позиционное картирование (клонирование) — наиболее перспективный метод картирования локусов различных наследственных заболеваний с неизвестным биохимическим дефектом. Этот метод, предложенный в 1980 г., основан на анализе сцепления между геном заболевания и аллелями полиморфных ДНК-маркеров в семьях, что стало возможным лишь при построении подробной генетической карты генома человека. По сути метод является генетическим картированием, необязателен и последующий скрининг на мутации в генах-кандидатах, лежащих внутри картированной области (позиционных кандидатов). Именно таким способом в настоящее время выявляют гены, ответственные за наследственные заболевания, и изучают генетические механизмы сложных мультифакториальных заболеваний, в том числе и рака. Можно с уверенностью утверждать, что с помощью этого метола при наличии сиквенса всего генома человека будет достигнут значительный прогресс в дальнейших исследованиях по генетике человека, как в норме, так и при патологии.

картирование генов человека

Методика картирования локуса наследственного заболевания подробно описана в нашей статье. Метод позиционного картирования лежит в основе классической схемы полногеномного скрининга.

Применение метода позиционного картирования имеет и свои ограничения. При наличии карт сцепления с разрешающей способностью 1сМ и использовании дополнительных маркеров из области сцепления на практике критический размер области локализации патологического гена составляет 3—5 сМ. Это связано с ограниченным числом мейозов, доступных для анализа. Для регистрации рекомбинаций между повреждением в ДНК, приводящим к заболеванию, и аллелем полиморфного маркера, удаленного на расстояние 1 сМ, в среднем необходимо проанализировать 100 мейозов, а в большинстве работ по картированию анализируется меньшее число. К тому же в интервале 3-5 сМ может находиться от 30 до 50 генов, что значительно затрудняет выявление конкретного гена заболевания. Таким образом, классическая схема полногеномного скрининга позволяет определить локус заболевания, но не обладает разрешающей способностью, достаточной для последующей идентификации патологического гена.

Генетические технологии, обеспечивающие более точную локализацию генов называют тонким генетическим картированием. Тонкое генетическое картирование основано на определении гаплотипов (сцепленных групп аллелей) в популяциях больных и здоровых индивидов по нескольким полиморфным маркерам, которые наиболее тесно сцеплены с геном, ответственным за заболевание. Этот метод эффективен, если среди мутаций, приводящих к заболеванию, имеются одна или несколько частых. Хромосомы, несущие мажорные мутации, в большинстве случаев представляют собой потомки одной мутантной хромосомы — т.е. наблюдается так называемый «эффектоснователя». Очевидно, что изначально все потомки хромосомы-основателя имели один и тот же гаплотип, который постепенно размывался в последующих поколениях за счет рекомбинационных событий.

Анализ производных гаплотипа хромосомы-основателя, специфического для данной мутации, позволяет локализовать древние сайты рекомбинаций, которые привели к распаду гаплотипа и, таким образом, уточнить место мутационного повреждения в гене. Параллельно данный подход позволяет определять порядок тесно сцепленных полиморфных маркеров, В отличие от традиционного генетического картирования, где для каждой семьи выявляются рекомбинации, произошедшие в течение нескольких мейозов, при таком подходе анализируются рекомбинации, произошедшие за времена, сравнимые со временем жизни мутации в популяции. Соответственно значительно возрастает и разрешающая способность метода.

Эффективность этого подхода определяется, прежде всего, наличием мажорной мутации и ее возрастом. Если такой мутации не существует, имеет смысл провести аналогичные исследования в других популяциях. Обнаружение неравновесия только в одной популяции может обеспечить успешность проведения тонкого генетического картирования гена, ответственного за возникновение заболевания. На основании анализа неравновесного сцепления можно определить возраст мутации. Описанная схема позволяет картировать локус, повреждения в котором приводят к заболеванию, с точностью порядка 0,1 сМ, что соответствует длине последовательности 100—200 т.п.н, В такой достаточно узкой области может быть проведен поиск мутаций во всех расположенных в ней генах.

Успешность применения различных вариантов поиска сцепления зависит от конкретной ситуации. Классический полногеномный скрининг хорошо зарекомендовал себя для анализа больших семей с количеством мейозов, достаточным для установления достоверного сцепления. Этот метод применим и к выборке семей с одинаково четкой клинической картиной заболевания. При исследовании ограниченного числа мейозов или выборок с возможной генетической гетерогенностью заболевания эффективность полногеномного скрининга снижается. Для малого числа мейозов невозможно получить достаточный Lod-балл (больше трех). С другой стороны, высока вероятность получить положительный Lod-балл меньше трех в нескольких независимых точках. Для гетерогенной выборки возможно ложное исключение истинно сцепленного локуса. В этих случаях имеет смысл проводить поиск сцепления с кандидатными локусами, анализируя каждую из имеющихся семей по отдельности, В случае определения сцепленного локуса для эффективного уменьшения области возможной локализации мутации, приводящей к заболеванию, хорошо зарекомендовал себя метод тонкого генетического картирования.

Позиционно-кандидатиое картирование основано на выявлении кодирующих последовательностей (кДНК или внутригенных еSТS) в области хромосомной локализации гена с неизвестным биохимическим продуктом путем анализа генетических и транскрипционных карт. Вероятность того, что одна из таких последовательностей окажется геном данного заболевания, достаточно высока. При наличии молекулярных характеристик гена-каццидата проводят его мутационный анализ. В ряде случаев для выделения геномного клона используют «кандидатные» маркеры экспрессируюшихся последовательностей (EST — от англ. expressed sequences tags) в качестве зондов. Вьшеленный клон секвенируют и проводят его мутационный анализ. Этот метод очень эффективен при наличии высокоразрешающих физических и транскрипционных карт.

Использование для картирования локусов наследственных заболеваний EST предполагает предварительные исследования по их скринингу. Скрининг ДНК-маркеров, распределенных по геному, может быть оптимизирован, если принять во внимание особенность организации генома, заключающуюся в том, что картированные EST распределяются по хромосомам неравномерно — имеются «богатые» и «бедные» генами участки. На основании этого рекомендуется в первую очередь использовать для картирования микросателлитные маркеры, лежащие в EST-богатых участках хромосом. Разработано два набора таких маркеров: набор А включает 40 маркеров, покрывающих примерно 1/10 генома (принимая, что каждый маркер позволяет анализировать ~ 10 сМ прилежащей геномной области) и набор В, состоящий из 25 маркеров, который позволяет проанализировать сцепление еще с 2200 EST, лежащими в пределах 10 сМ-интервала от каждого маркера (на каждый маркер из набора В приходится в среднем по 88 картированных EST). Таким образом, исследование 65 маркеров из наборов А и В, покрывающих лишь 17% всего генома, позволяет анализировать сцепление с 40% всех известных EST Такой подход сокращает время и стоимость исследования по определению локусов наследстве иных заболеваний.

- Читать далее "Геномика. Виды геномики. Задачи геномики."

Оглавление темы "Геномика. Медицинская генетика.":
1. Стратегия картирования генов человека. Методы полногеномного скрининга.
2. Геномика. Виды геномики. Задачи геномики.
3. Достижения геномики. Цели геномики.
4. Перспективы геномики. Фармакогеномика.
5. Биоэтические проблемы геномики. Деонтология и геномика.
6. Медицинская генетика. Задачи медицинской генетики.
7. Наследственные болезни. Классификация наследственных болезней.
8. Гинеалогический метод. Клинико-генеалогический метод.
9. Близнецовый метод. Задачи и методика близнецового метода.
10. Популяционные методы медицинской генетики. Статистические методы медицинской генетики.

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: