Стандартизация тест систем на мутагенность. Современные тесты мутагенности.

Публиковавшиеся в периодических научных изданиях результаты тестирования на мутагенность свидетельствовали об отсутствии единого стандарта в этой процедуре. В экспериментах in vitro различия чаше всего касались условий метаболической активации, in vivo — уровня доз, путей введения, сроков экспозиции и некоторых других экспериментальных параметров. Значительным итогом многолетнего обобщения результатов разработки и стандартизации испытаний на генотоксичность явилось выпушенное в 1989 г. ВОЗ «Руководство по краткосрочным тестам для выявления мутагенных и канцерогенных химических веществ», а также материалы 2-го Международного рабочего совещания в Мельбурне 1994 года.

Фармакологический комитет МЗ и МП Российской федерации в 1994 г. опубликовал нормативный документ — методические рекомендации «Опенка мутагенности новых лекарственных средств».

В рамках курируемой ВОЗ Международной программы по химической безопасности (International Programme on Chemical Safety, IPCS) были разработаны методические рекомендации для мониторинга генотоксических влияний на организм человека мутагенов и канцерогенов. В последней версии рекомендаций от 2000 г. предлагается следующий набор тестов:

1) цитогенетические методы — классический анализ хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови, флуоресцентная гибридизация in situ (FISH), определение микроядер (МЯ) влимфоцитах и эпителиальных клетках;
2) анализ повреждений ДНК - определение аддуктов, одно- и двухцепочечных разрывов, перекрестных сшивок, шелочелабильных сайтов с помощью биохимических и электрофоретических (кометный тест) методик, определение сестринских хроматидных обменов (СХО);
3) учет образования аддуктов мутагена с белками и мутаций в локусе гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы (ГГФРТ).

тест системы на мутагенность

Один из рекомендованных тестов — кометный (гель-электрофорез отдельной клетки) позволяет определить одно- и двущепочечные разрывы, щелочелабильные сайты, перекрестные сшивки молекул ДНК, а также участки с неполной эксцизионной репарацией в индивидуальной клетке. Материалом для кометного теста могут служить лейкоциты и лимфоциты периферической крови, сперматозоиды, буккальные клетки, клетки желудочного и назального эпителия, суспензию которых заключают в агарозный слой на предметном стекле. Затем клетки лизируют детергентами или растворами солей, и высвобожденную ДНК подвергают электрофорезу в нейтральных или щелочных условиях. ДНК отдельной клетки в процессе миграции к аноду образует так называемую «комету» с характерными «головой» и «хвостом», которую визуализируют с помощью флуоресцентной или световой микроскопии после окрашивания соответствующими красителями.

При повреждении ДНК процесс ее миграции к аноду нарушен. Подсчитывают длину кометы, длину хвоста и момент хвоста (отношение длины хвоста к длине всей кометы). Нейтральный вариант кометного теста позволяет определить двухцепочечные разрывы ДНК, щелочной вариант (в зависимости от значения рН) - одно- и двухцепочечные разрывы, шелочелабильные сайты, участки с неполной эксцизионной репарацией, перекрестные сшивки ДНК-ДНК и ДНК-белок.

Чрезвычайно важно, что с помощью этого метода удается выявить фракцию клеток с поврежденной ДНК внутри большой популяции непораженных клеток. Разные модификации метода (применение специфических антител против поврежденных участков или специфических ферментов репарации ДНК) позволяют определить специфические классы аддуктов ДНК (например, тимидиновые димеры, участки окислительного повреждения).

Согласно другому документу IPCS (2001 Г.) «Биомаркеры при оценке риска. Валидность и верификация», после окончательной расшифровки генома человека наибольшую роль при определении генотоксических воздействий будут играть методики выявления полиморфизма одиночных нуклеотидов и технологии создания микроматриц и микрочипов ДНК и белков.

Тем не менее, пока в большинстве случаев оценка генетического риска основана на экстраполяции экспериментальных данных от одного тест-объекта на другой, от высоких доз на низкие и т.д., и, в конечном итоге, от модельных систем in vitro/in vivo — на человека.

Практически все исследователи считают проблему количественной экстраполяции чрезвычайно затрудненной, если вообще возможной. Причиной тому являются видовые, возрастные и индивидуальные особенности метаболизма, а также детоксицирующих и сепарирующих систем и многих других параметров. Метаболические особенности человека могут существенно повышать или понижать мутагенный эффект химических соединений. Следовательно, для правильной экстраполяции необходимо знать метаболизм конкретного мутагена и у животных, и у человека.

Кроме того, количественные закономерности мутационного процесса неодинаковы у разных животных, в том числе, и при сравнении их с человеком. В зависимости от состава сравниваемых пар индуцированный мутагенез у человека может быть выражен сильнее или слабее. Например, показано, что человек более устойчив к мутагенному действию радиации, чем мышь. Не исключено, что таково же соотношение и в случае действия химических мутагенов. Существование количественных различий в результатах индуцированного радиационного мутагенеза связано с видовыми особенностями функционирования репарационных систем, которые способны восстанавливать первичные повреждении, имеющие потенциальный характер и не обязательно реализующиеся в мутации.

Немаловажно и то, что диапазон тех доз, которые используют в эксперименте, как правило, на 2 порядка и более отличается от тех, с которыми реально сталкивается человек. И это только малая часть трудностей, описанию которых можно было бы посвятить отдельную главу.

Тем не менее, в 1980 г. Ф. Собелсом сформулировал принцип экстраполяции, получивший название «правило параллелограмма». Его используют в тех случаях, когда необходимые данные невозможно получить путем прямых измерений. Например, в экспериментах на мышах можно сравнить частоту мутаций в соматических (А) и зародышевых (А') клетках. Установив частоту индуцированных мутаций в соматических клетках человека (В) и предположив, что отношение частот мутаций в зародышевых клетках к частотам в соматических одинаковое у мыши и человека (А/А' = В/В'), можно составить представление о возможной частоте мутаций в зародышевых клетках человека (В'), Правило параллелограмма допустимо применять строго при условии линейной зависимости эффекта от дозы. Несмотря на такое ограничение, правило параллелограмма может оказывать реальную помощь для оценки генетического риска влияния мутагенов. Это было подтверждено, в частности, на примере четырех мутагенов: акриламида, этиленоксида, циклофосфана и 1,3-бутадиена.

Н.П, Бочков и А.Н. Чеботареве 1989 г., предложили схему, отражающую принцип прогнозирования мутагенного эффекта в зародышевых клетках по имеющимся данным одействии тестируемого соединения надругие объекты и закономерностям сопоставления эффектов в различных системах. Те же авторы в качестве одного из основных условий, повышающих точность экстраполяции, выдвигают максимально возможное сокращение числа ее ступеней и подчеркивают важность расширения знаний о мутационном процессе для объективного выбора моделей и выяснения границ экстраполяционных возможностей.

- Читать далее "Нехромосомная наследственность. Наследственность не связанная с хромомсомами."

Оглавление темы "Мутагенез. Внехромосомная наследственность.":
1. Закономерности спонтанных мутаций. Течение спонтанного мутационного процесса.
2. Гомологические ряды. Закон гомологических рядов наследственной изменчивости.
3. Антимутагены. Ингибиторы мутагенеза.
4. Выявление мутагенов. Мутагенные факторы окружающей среды.
5. Тестирование на мутагенность. Стратегия тестирования на мутагенность.
6. Генотоксичность. Тест системы на генотоксичность.
7. Стандартизация тест систем на мутагенность. Современные тесты мутагенности.
8. Нехромосомная наследственность. Наследственность не связанная с хромомсомами.
9. Хлоропласт. Пластидный или хлоропластный геном.
10. Митохондрии. Митохондриальный геном.

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: