Метод дифференциального дисплея. Техника и значение метода дифференциального дисплея

Метод дифференциального дисплея был разработан в 1992 году P. Liang и A-Pardee. Авторы исходили из предположения, что в клетке экспрессируется =15 тыс. генов. В принципе, на основе каждой индивидуальной молекулы иРНК можно получить фрагмент кодирующей ее ДНК путем обратной транскрипции (кДНК). Затем этот фрагмент можно многократно воспроизвести методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). При постановки ПЦР авторы использовали необычную пару праимеров.

Прямой праймер — короткая последовательность из 10 нуклеотидов произвольного состава — заякоривающий основания (произвольный праймер). Обратный праймер состоял из двух частей. К нескольким остаткам дезокситимина (олигоT) присоединяются два дополнительных нуклеотида произвольного содержания. Наличие олиго-dT последовательностей позволяет выделить только поли-А содержащую иРНК. Одновременно она является затравочной молекулой в реакции обратной транскрипции. Прямой праймер позволяет синтезировать большое разнообразие кДНК разной длины.
Это связано с тем, что возможность локализации данной последовательности в одном и том же месте в иРНК, транскрибированных с разных генов, крайне мала.

После амплификации набор кДНК разделяют путем электрофореза в полиакриламидном геле и проводят сравнительный анализ различных фрагментов электрофореграмм в опытных и контрольных образцах. Интересующие фрагменты выделяют из геля, определяют путем секвенирования первичную структуру кДНК, проводят компьютерный анализ и с помощью банков данных нуклеотидных последовательностей идентифицируют выявленные гены.

дифференциальный дисплей

Если использовать большое количество прямых произвольных праимеров, варьируя их нуклеотидныи состав, и изменять все возможные сочетания двух пар нуклеотидов в Т-якорном праймере, то можно получить информацию о значительном числе транскриптов.

Метод дифференциального дисплея относительно простой в исполнении, не требует больших затрат, средств и времени, позволяет работать с небольшим количеством исходного материала, из-за чего нашел широкое применение в научных исследованиях. Однако этот метод имеет ограничения и недостатки. Во-первых, праймеры, которые применяются в ПЦР, имеют низкую температуру гибридизации с матрицей (40°С), что снижает специфичность амплификации и ведет к появлению ложно-положительных результатов. На электрофореграмме видно множество избыточных полос, которые не соответствуют реальной дифференциальной экспрессии.

Проблема артефактов решается путем модификации структуры праймеров, изменения условий ПЦР, повторяя исследования. Дальнейшему анализу подвергались лишь постоянно проявляющиеся полосы. Во-вторых, при амплификации образуются преимущественно короткие (200—300 п. н.) фрагменты, несущие информацию о 3-нетранслируемых областях иРНК. Их определение недостаточно для идентификации генов и предсказания их функций. Изменяя условия ПЦР, удалось получить фрагменты кДНК длиной свыше 2 тыс. п. н. Однако самым серьезным недостатком считается невозможность проведения систематического сравнения анализируемых образцов по всем видам иРНК. На основе стандартного метода дифференциального дисплея разработан ряд модификаций, направленных на преодоление ограничений и повышение чувствительности и воспроизводимости методики.

- Читать далее "Метод вычитающейся гибридизации. Метод репрезентативного дифференциального анализа"

Оглавление темы "Фармакогеномика и фармакогенетика":
1. Биоаналитические системы в фармакологии. Биоаналитическая аппаратура
2. Дозированные касеты в фармации. Взаимосвязь структуры веществ—фармакокинетических свойств
3. Фармакогеномика. Протеомика и геном человека
4. Расшифровка первичной структуры белков. Секвенирование генома человека
5. Дифференциальная экспрессия гена. Экспрессия генов на фоне болезней
6. Требования и характеристики ДГЭ. Закрытая архитектурная система по генетике
7. Матрица ДНК-чипа. Открытая архитектурная система в фармации
8. Метод дифференциального дисплея. Техника и значение метода дифференциального дисплея
9. Метод вычитающейся гибридизации. Метод репрезентативного дифференциального анализа
10. Результат ДГЭ. Фармакогенетика

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: