Гликозидаза семенной жидкости. Определение концентрации гликозидазы в семенной плазме

В семенной плазме содержатся как нейтральный изоэнзим а-гликозидазы, вырабатываемый в придатке яичка, так и кислый изоэнзим, вырабатываемый в предстательной железе. Кислый изоэнзим селективно ингибируют. Для оценки функции придатка яичка измеряют его специфический маркер - нейтральную а-гликозидазу. Имеются коммерческие наборы для измерения а-гликозидазы в плазме эякулята. Наборы подходят для планшетных ридеров с 96 ячейками. Объемы эякулята и реагентов можно пропорционально изменять для спектрофотометра, используя кюветы с объемом 1 и 3 мл. При подсчете результатов следует внести соответствующие коррективы.
Реагенты. Фосфатный буфер 0,2 моль/л, рН 6,8: приготовить 0,2 М К2НР04*3Н20 (растворить 4,56 г в 100 мл) и 0,2 М КН2Ю4 (растворить 2,72 г в 100 мл). Смешивать объемы, пока pH не достигнет 6,8.

Буфер, содержащий 1% раствор додецил-сульфата натрия (ДДС): растворить 1 г ДДС в 100 мл полученного буфера. При хранении при 4 °С буфер выпадает в осадок, однако при острожном нагревании происходит растворение осадка.
Цветной реагент 1 (для остановки реакции): 0,1 М Na3CCyH20. Растворить 6,20 г Na2C03 x Н20 в 500 мл воды.

Цветной реагент 2 (для разведения): смесь цветного реагента 1 и 1% раствора ДДС.
Субстрат - паранитрофенол-а-гликопиранозид (ПНГП), 5 г/л: нужное количество готовить перед каждым анализом, растворяя 1 г ПНГП (Sigma) в 20 мл буфера, содержащего 1% раствор ДДС. Раствор нагреть, помешивая при 50 °С в течение 10 мин. Некоторые кристаллы могут не раствориться. Хранить рабочий раствор при 37 °С.

Ингибитор гликозидазы для контрольных образцов эякулята (кастаноспермин): основной раствор (10 мМ) получают, растворив 1 мг кастаноспермина (Sigma) в 10 мл воды. Рабочий раствор (1 мМ) получают добавлением нужного объема воды. Хранить в аликвотах при -20 °С.

семенная жидкость

Стандартный раствор - 5 мМ паранитрофенола (ПНФ): растворить 0,0695 г ПНФ (Sigma) в 100 мл воды. При необходимости нагреть раствор. Хранить при 4 °С в темно-коричневых бутылях. Готовить свежий стандартный раствор каждые 3 месяца. Ход определения

Построить калибровочный график (в течение последнего часа инкубации): - поместить 0,4 мл основного раствора ПНФ (5 мМ) в мерную колбу объемом 10 мл и довести объем до 10 мл, добавив цветной реагент 2 (200 мкМ); развести 200 мкМ стандарта цветным реагентом 2 для получения дополнительных стандартов - 160,120, 80 и 40 мкМ раствора ПНФ. Приготовить образцы: эякулят центрифугировать при 1000 g в течение 10 мин, затем забрать семенную плазму. До анализа плазму хранить при -20 °С; плазму разморозить и тщательно размешать на вортекс-миксере (в каждое исследование включать контрольные образцы, содержащие нейтральную а-гликозидазу с высокой, средней и низкой активностью); пипеткой перенести в пробирки объемом 1,5 мл два образца эякулята (по 15 мкл).

Также перенести в пробирки два контроля (по 15 мкл воды), по два контрольных образца, содержащих гликозидазу с низкой и средней активностью, и четыре контрольных образца, содержащих гликозидазу с высокой активностью; добавить в два контрольных образца, содержащих гликозидазу в высокой концентрации, 8 мкл кастаноспермина (1 мМ); добавить по 100 мкл раствора ПНГП (при 37 °С) в каждую 1,5 мл пробирку Эппендорфа; перемещать каждую пробирку на вортекс-миксере и инкубировать в течение 2 часов при 37 °С (необходимо точно соблюдать температурный и временной режимы);
- через 2 часа остановить инкубацию, добавить по 1 мл цветного реагента 1 и перемешать;
- перенести по 250 мкл образцов и стандартов в 96-луночную плашку; измерить абсорбцию при длине волны 405 нм в планшет-ридере в течение 60 мин, используя воду в качестве контроля для установки нулевого значения. Расчет результатов
- 1 единица (ЕД) активности а-гликозидазы = продукция 1 мкмоль ПНФ за 1 мин инкубации при температуре 37 °С. В этом исследовании активность выводится от 15 мкл эякулята при общем объеме 1,115 мл за 120 мин, следовательно, коэффициент коррекции будет составлять 1115/15/120 (=0,6194).

Определить концентрацию полученного ПНФ в образце по калибровочному графику (мкМ).
Умножить результат на коэффициент коррекции (0,6194) для получения активности нейтральной гликозидазы в неразведенной семенной плазме (ЕД/л).

Вычитать от каждого полученного результата активность (ЕД/л) контрольных образцов эякулята, содержащих кастаноспермин, для получения скорректированных (относящихся к гликозидазе) значений активности.
Умножить скорректированный результат на объем эякулята для получения значения активности гликозидазы (МЕ/эякулят).
Следует забраковать результаты, выходящие за рамки верхнего стандарта, а измерение повторить после разведения.
Референтные значения: 20 ME в эякуляте (минимальное значение),
Для биохимического исследования эякулята существуют также готовые наборы реактивов (например, «Ferti Pro», Бельгия)

- Читать далее "Достоверность исследования семенной жидкости. Контроль качества исследований эякулята"

Оглавление темы "Состав эякулята. Биохимия эякулята":
1. Выявление антител к сперматозоидам. Тест Фриберга
2. Смешанная реакция агглютинации сперматозоидов. Тест сперматозоидов с латексными частицами
3. Непрямой тест сперматозоидов с иммунными шариками. Исследование взаимодействия сперматозоидов с цервикальной слизью
4. Получение цервикальной слизи. Оценка цервикальной слизи
5. Биохимическое исследование спермы. Биохимический состав эякулята
6. Определение концентрации фруктозы в эякуляте. Концентрация цитрата, цинка в эякуляте
7. Гликозидаза семенной жидкости. Определение концентрации гликозидазы в семенной плазме
8. Достоверность исследования семенной жидкости. Контроль качества исследований эякулята
9. Внешний контроль исследований эякулята. Ошибки исследования спермы

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: