Концентрация фруктозы в сперме тесно связана с уровнем тестостерона в организме. Снижение продукции тестостерона сопровождается уменьшением концентрации фруктозы в сперме. Определение скорости катаболизма фруктозы характеризует интенсивность метаболизма фруктозы в сперматозоидах.
Классическим методом определения концентрации фруктозы в сперме является метод Roe.
Принцип: фруктоза в сильнокислой среде образует оксиметилфурфурол, который дает с резорцином вещество, окрашенное в ярко-красный цвет.

Ход определения. К 0,1 мл эякулята или спермоплазмы добавляют 0,4 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ), перемешивают и через 10 мин центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин. Отбирают 0,1 мл супернатанта, к нему добавляют 2,5 мл 30% раствора соляной кислоты и 0,25 мл 0,1% раствора резорцина в 95% этаноле, перемешивают и помещают в водяную баню при температуре 80-90 °С на 8 мин. Пробы охлаждают и фотометрируют при длине волны 530 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см против холостой пробы. Холостую пробу готовят как опытную, но вместо эякулята добавляют 0,1 мл 10% раствора ТХУ. Окраска стабильна в течение 2-3 часов. Расчет концентрации фруктозы производят по калибровочному графику.
Из каждого разведения отбирают по 0,1 мл и обрабатывают как опытную пробу.

По полученным значениям экстинкции строят калибровочный график. Расчет можно проводить по формуле: фруктоза = Eon*Cкал/Eкал, где Еon - экстинкция опытной пробы, Скал - концентрация фруктозы в калибровочной пробе, Екап - экстинкция калибровочной пробы.
Некоторое неудобство метода - большой объем пробы.

Микрометод определения концентрации фруктозы

В качестве хромогена используется тиобарбитуровая кислота.
Реактивы:
1. Стандарт фруктозы 5,6 мкмоль/мл (1 мг/мл), содержащий 0,1% азида натрия.
2. 3% раствор ТХУ.
3. 0,02 М водного раствора тиобарбитуровой кислоты (хромоген).
4. Концентрированная соляная кислота. Ход определения

По 0,01 мл стандарта и спермоплазмы пипетируют в пробирки с 1 мл 3% ТХУ, перемешивают и через 10 мин центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин. Супернатант сливают полностью в пробирку со шлифом, добавляют по 1 мл раствора хромогена (реактив 3) и концентрированной соляной кислоты, пробирки закрывают и инкубируют в кипящей водяной бане 6 мин. Пробы охлаждают, смывают конденсат, измеряют оптическую плотность в кювете с длиной оптического пути 1 см при длине волны, равной 433 нм, против холостой пробы, которая готовится как опытная, но вместо спермоплазмы добавляется 1 мл 3% ТХУ. Для измерения можно использовать любой ФЭК с фильтром близкой длины волны.
Метод линеен в диапазоне от 1,4 до 38,9 мкмоль/мл (0,25-7,0 мг/мл). Нормальные значения - 6,7-33,3 мкмоль/мл (1,2-6 мг/мл).

Определение концентрации лимонной кислоты

Концентрация лимонной кислоты отражает функциональное состояние предстательной железы и эндокринной функции яичек.
Принцип метода: при взаимодействии цитрата с уксусным ангидридом образуются лактоны, продукция которых ускоряется пиридином при нагревании. Продукты реакции имеют желтое окрашивание. Калибровочный раствор лимонной кислоты 10 ммоль/л.
Расчет производится по формуле: Цитрат = Eon*Cкал/Eкал. Референтные значения: >20 ммоль/л.

Определение концентрации цинка

Цинк при рН 8,8 формирует со специфическим комплексантом 2-(5-бромо-2-пиридазол)-5-(N-пропил-N-сульфопропиламино)-фенолом (5-Br-ППФ) комплекс, интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации цинка.
Реактивы А- 5 х 10 мл; буфер рН 8,8, добавки; В - 1 х 5 мл; комплексант 5-Вг-ППФ; С - 1 флакон; усилитель реакции; Стандарт - раствор цинка 200 мкг/дл (30,6 мкмоль/л).
Приготовление реактивов. Раствор АС: 1 ложечку реактива С добавить во флакон с реактивом А, перемешать (срок хранения 30 дней при 2-8 °С).

Хромогенный раствор: 10 объемов р-ра АС + 1 объем реактива В (срок хранения 10 дней при 2-8 °С).
Ход определения. Эякулят центрифугируют при 3000 об/мин 10-15 мин. Супернатант разбавляют физиологическим раствором в 100 раз. При расчете концентрации цинка учитывают разведение.
Длина волны 560 нм, длина оптического пути 1 см, температура 25, 30 или 37 °С, соотношение объемов образца и реактива 1:20.

Перемешать и измерить поглощение образца (As) и стандарта (Ast) против бланка при 560 нм. Окраска стабильна в течение 1 часа. Расчет: (As/Ast) х 200 = мкг Zn/дл образца или (As/Ast) х 30,6 - мкмоль Zn/л образца. Референтные значения: 2-10 мкг/дл или 0,3 1,5 мкмоль/л.
Наборы для определения биохимических маркеров фертильности (лимонная кислота, фруктоза, акросомальный белок акрозин и др.) можно приобрести в России.

- Читать далее "Гликозидаза семенной жидкости. Определение концентрации гликозидазы в семенной плазме"