MAR-тест с антителами класса IgA и IgG проводят путем смешивания образца нативного эякулята с частичками латекса или эритроцитами, покрытыми человеческими антителами класса IgA или IgG. К этой смеси добавляют моноспецифическую IgG-антисыворотку. Образование смешанных агглютинатов между частичками и подвижными сперматозоидами показывает, что последние покрыты антителами класса IgA или IgG. Однако диагноз иммунологического бесплодия должен быть подтвержден тестами на взаимодействие сперматозоидов с цервикальной слизью.
В модификации теста (Bronson, 1984) вместо эритроцитов используются частицы латекса.

Тест с латексными частицами. Частицы латекса представляют собой полиакриламидные сферы, ковалентно связанные с кроличьими иммуноглобулинами против глобулинов человека. При помощи этого теста одновременно можно определять наличие антител класса IgA и IgG.

Процедура анализа. Модификация на нашивном эякуляте. На предметное стекло наносят 10 мкл неотмытого эякулята, 10 мкл латексных частичек, покрытых IgG или IgA (коммерческого производства), и 10 мкл антисыворотки к IgG или IgA человека.

Сначала перемешивают капли эякулята и латексных частичек, покрытых IgG (или IgA), затем добавляют к ним каплю антисыворотки. Накрывают смесь покровным стеклом большего размера. Через 2-3 мин и еще раз через 10 мин исследуют препарат в фазово-контрастном либо в световом микроскопах при увеличении х400 или х6ОО.

Если сперматозоиды не покрыты антителами, то при исследовании видно, что они свободно двигаются между частичками, которые склеиваются между собой и образуют группы (это подтверждает, что препарат приготовлен правильно).

Если же сперматозоиды покрыты антителами, то к подвижным сперматозоидам прикрепляются частички латекса. Постепенно агглютинаты становятся настолько массивными, что подвижность сперматозоидов резко ограничивается.
Следует подсчитать, по крайней мере, 200 сперматозоидов и выявить процент подвижных, к которым прикреплены латексные частички.

Модификация на отмытом эякуляте. Сперматозоиды отделяют от семенной жидкости двукратным центрифугированием, осадок смешивают с буфером для получения суспензии. Суспензию сперматозоидов смешивают с суспензией латексных частиц. Полученный препарат исследуют под фазово-контрастным микроскопом при увеличении х400. Латексные частицы склеиваются с подвижными сперматозоидами, на поверхности которых имеются антитела.

Проводят подсчет сперматозоидов (в процентах), связанных с латексом, отмечают характер связывания. Класс антител можно установить, применяя различные сорбированные на латексе иммуноглобулины. Считается, что не менее 50% подвижных сперматозоидов должны быть покрыты антителами, чтобы существенно нарушились пенетрация сперматозоидами цервикальной слизи и оплодотворение in vivo. На основании этого, как минимум, 50% подвижных сперматозоидов должны быть связаны с латексными частицами, чтобы считать тест клинически значимым. Связывание латексных частиц с кончиками хвостов сперматозоидов не обязательно ассоциируется с нарушением фертильности и может встречаться у здоровых мужчин.

Тест сперматозоидов с иммунными шариками

Коммерческие иммунные шарики анти-IgG, -IgA и -IgM могут идентифицировать все изотипы иммуноглобулинов. Шарики разводят согласно инструкции производителя. Эту смесь с добавлением консерванта можно хранить в течение нескольких месяцев при температуре 4 °С.

Основной буфер: можно использовать раствор Тироде (Tyrode) или фосфатно-буферную среду (ФБС) Дульбекко (Dulbecco). Оба раствора можно приобрести в разных компаниях или составить по прописи.
Буфер I; содержит 0,3% раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА). Отвесить 0,3 г БСА и довести до объема 100 мл добавлением основного буфера.
Буфер II; содержит 5% раствор БСА. Отвесить 5 г БСА и довести объем до 100 мл добавлением основного буфера.

Перед использованием все растворы следует отфильтровать через микрофильтры 0,22 или 0,45 мкм и подогреть до температуры 25-35 °С.
В отдельные конические центрифужные пробирки налить по 0,2 мл основной суспензии каждого класса иммунных шариков и 10 мл буфера I.
Налить в конические центрифужные пробирки требуемое количество эякулята и довести объем до 10 мл буфером I.
Все пробирки отцентрифугировать при 500 g в течение 5-10 мин.

Из пробирок со сперматозоидами слить супернатант, осторожно развести осадок сперматозоидов в 10 мл свежего буфера I и снова отцентрифугировать при 500 g в течение 5-10 мин. Отделить и слить супернатант. Осторожно развести осадок сперматозоидов в 0,2 мл буфера II.

Из пробирок с иммунными шариками отделить и слить супернатант. Осторожно развести суспензию с латексными частицами в 0,2 мл буфера II. Нанести капли (5 мкл) шариков каждого класса на одно или несколько предметных стекол. К каждой капле добавить по 5 мкл отмытой суспензии сперматозоидов и тщательно перемешать, используя либо кончик пипетки, либо край покровного стекла. Каждую каплю смеси накрыть покровным стеклом, поместить препарат на 10 мин во влажную камеру и исследовать под фазово-контрастным микроскопом при увеличении х400, х600.

Подсчитать отдельно процентное содержание подвижных сперматозоидов, к которым прикрепилось два и более иммунных шарика (не учитывать прикрепление к кончику хвоста сперматозоида). Дважды подсчитать, по крайней мере, по 200 подвижных сперматозоидов в каждом препарате. Отметить класс (IgA или IgG) и место прикрепления иммунных шариков к сперматозоиду (головка, средняя часть, хвост).

Интерпретация. Тест считается положительным и клинически значимым, если 50% и более подвижных сперматозоидов покрыты иммунными шариками. Прикрепление иммунных шариков к кончику хвоста сперматозоида не считается клинически значимым.

- Читать далее "Непрямой тест сперматозоидов с иммунными шариками. Исследование взаимодействия сперматозоидов с цервикальной слизью"