В Институте гематологии и трансфузиологии АМН Украины с 1995 года развивается научное направление, целью которого является всестороннее исследование пуповинной крови как альтернативного источника стволовых гемопоэтических клеток. В частности, разработаны новые технологии низкотемпературного криоконсервирования гемопоетических клеток нефракционированной и фракционированной пуповинной крови.

В качестве криопротектора используется низкомолекулярный медицинский поливинилпиролидон. В основе способа криоконсервирования нефракционированной кордовой крови лежит оригинальная технология предподготовки клеток к замораживанию и методика специальной обработки клеточной суспензии непосредственно перед трансплантацией (Когут и др., 1998).

Перспективным направлением оптимизации методов криоконсервирования костного мозга и клеток пуповинной крови является сочетание в одном растворе низких концентраций нескольких криопротекторов с различным механизмом действия, например, действующего на внутриклеточном уровне ДМСО и гидроксиэтилкрахмала или альбумина, обладающих экстрацеллюлярным ограждающим эффектом (Чуйков, 1989).

Для криоконсервации клеток кордовой крови традиционно используется 20% раствор ДМСО, который, постоянно механически помешивая на ледяной бане, медленно вливают в клеточную взвесь до достижения равного (1:1) соотношения объемов криопротектора и клеточной суспензии.

Модификации методик криоконсервации направлены на снижение концентрации ДМСО за счет добавления гидроксиэтилкрахмала (конечные концентрации диметилсульфоксида pi гидроксиэтилкрахмала составляют соответственно 5 и 6%). Высокая эффективность такого сочетания криопротекторов наблюдается при замораживании суспензии миелоидных клеток, причем с не меньшей цитопротекциеи, чем при использовании одного только 10% раствора диметилсульфоксида. Количество жизнеспособных ядросодержащих клеток достигало 96,7% от исходного уровня, а функциональная их активность, оцененная по числу CFU-GM, составляла 81,8% (Stiff et al, 1987).

При использовании раствора диметилсульфоксида в концентрациях от 5 до 10% в сочетании с 4% гидроксиэтилкрахмалом (конечная концентрация) установлено, что сохранность СD34-позитивных клеток в таких диапазонах диметилсульфоксида практически не изменяется. В то же время в условиях снижения концентрации диметилсульфоксида от 5 до 2,5% наблюдается массовая гибель клеток пуповинной крови — количество жизнеспособных клеточных единиц снижается с 85,4 до 12,2% (Donaldson et al., 1996). Другие авторы (Richter et al., 1998) также пришли к заключению, что именно 5 и 10% растворы диметилсульфоксида (в авторском варианте — в комбинации с аутологичной сывороткой) с максимальной эффективностью обеспечивают цитопротекцию при криоконсервировании ГСК пуповинной крови.

Кроме того, высокая сохранность последовательно замораживаемых и размораживаемых клеток отмечается в случае сочетания 5 или 10% диметилсульфоксида с 4% раствором гидроксиэтилкрахмала, особенно при контролируемой скорости охлаждения, равной 1С/мин. В еще одной работе (Herold et al., 1997) использовался криозащитный раствор, состоящий уже из трех ингредиентов — ДМСО, очищенного человеческого альбумина и среды RPMI в пропорции 1:4:5, который добавляли к клеточной суспензии до равного соотношения объемов (конечная концентрация диметилсульфоксида составила 5%). После размораживания на водяной бане при температуре +41°С сохранность CFU-GM превышала 94%.

Некоторые авторы предлагают использовать для криоконсервирования нефракционированную пуповинную кровь, поскольку в процессе удаления эритроцитов утрачиваются значительные количества гемопоэтических клеток. В этом варианте для защиты мононуклеарных клеток от повреждающего действия криокристаллизации используется 10% раствор диметилсульфоксида.

Замораживание проводится при постоянной скорости охлаждения, составляющей 1С/мин, до -80°С, после чего суспензию клеток кордовой крови опускают в жидкий азот. При данной методике замораживания происходит частичный лизис эритроцитов, поэтому образцы крови не требуют фракционирования. После размораживания клеточную взвесь отмывают от свободного гемоглобина и диметилсульфоксида в растворе человеческого альбумина или в сыворотке аутокрови больного и используют для трансплантации (Rubinstein et al., 1993, 1994).

- Читать далее "Сохранность гемопоэтических клеток-предшественников. Консервирование пуповинной крови"