Консервирование стволовых клеток. Криоконсервирование

В Институте гематологии и трансфузиологии АМН Украины с 1995 года развивается научное направление, целью которого является всестороннее исследование пуповинной крови как альтернативного источника стволовых гемопоэтических клеток. В частности, разработаны новые технологии низкотемпературного криоконсервирования гемопоетических клеток нефракционированной и фракционированной пуповинной крови.

В качестве криопротектора используется низкомолекулярный медицинский поливинилпиролидон. В основе способа криоконсервирования нефракционированной кордовой крови лежит оригинальная технология предподготовки клеток к замораживанию и методика специальной обработки клеточной суспензии непосредственно перед трансплантацией (Когут и др., 1998).

Перспективным направлением оптимизации методов криоконсервирования костного мозга и клеток пуповинной крови является сочетание в одном растворе низких концентраций нескольких криопротекторов с различным механизмом действия, например, действующего на внутриклеточном уровне ДМСО и гидроксиэтилкрахмала или альбумина, обладающих экстрацеллюлярным ограждающим эффектом (Чуйков, 1989).

Для криоконсервации клеток кордовой крови традиционно используется 20% раствор ДМСО, который, постоянно механически помешивая на ледяной бане, медленно вливают в клеточную взвесь до достижения равного (1:1) соотношения объемов криопротектора и клеточной суспензии.

стволовые клетки

Модификации методик криоконсервации направлены на снижение концентрации ДМСО за счет добавления гидроксиэтилкрахмала (конечные концентрации диметилсульфоксида pi гидроксиэтилкрахмала составляют соответственно 5 и 6%). Высокая эффективность такого сочетания криопротекторов наблюдается при замораживании суспензии миелоидных клеток, причем с не меньшей цитопротекциеи, чем при использовании одного только 10% раствора диметилсульфоксида. Количество жизнеспособных ядросодержащих клеток достигало 96,7% от исходного уровня, а функциональная их активность, оцененная по числу CFU-GM, составляла 81,8% (Stiff et al, 1987).

При использовании раствора диметилсульфоксида в концентрациях от 5 до 10% в сочетании с 4% гидроксиэтилкрахмалом (конечная концентрация) установлено, что сохранность СD34-позитивных клеток в таких диапазонах диметилсульфоксида практически не изменяется. В то же время в условиях снижения концентрации диметилсульфоксида от 5 до 2,5% наблюдается массовая гибель клеток пуповинной крови — количество жизнеспособных клеточных единиц снижается с 85,4 до 12,2% (Donaldson et al., 1996). Другие авторы (Richter et al., 1998) также пришли к заключению, что именно 5 и 10% растворы диметилсульфоксида (в авторском варианте — в комбинации с аутологичной сывороткой) с максимальной эффективностью обеспечивают цитопротекцию при криоконсервировании ГСК пуповинной крови.

Кроме того, высокая сохранность последовательно замораживаемых и размораживаемых клеток отмечается в случае сочетания 5 или 10% диметилсульфоксида с 4% раствором гидроксиэтилкрахмала, особенно при контролируемой скорости охлаждения, равной 1С/мин. В еще одной работе (Herold et al., 1997) использовался криозащитный раствор, состоящий уже из трех ингредиентов — ДМСО, очищенного человеческого альбумина и среды RPMI в пропорции 1:4:5, который добавляли к клеточной суспензии до равного соотношения объемов (конечная концентрация диметилсульфоксида составила 5%). После размораживания на водяной бане при температуре +41°С сохранность CFU-GM превышала 94%.

Некоторые авторы предлагают использовать для криоконсервирования нефракционированную пуповинную кровь, поскольку в процессе удаления эритроцитов утрачиваются значительные количества гемопоэтических клеток. В этом варианте для защиты мононуклеарных клеток от повреждающего действия криокристаллизации используется 10% раствор диметилсульфоксида.

Замораживание проводится при постоянной скорости охлаждения, составляющей 1С/мин, до -80°С, после чего суспензию клеток кордовой крови опускают в жидкий азот. При данной методике замораживания происходит частичный лизис эритроцитов, поэтому образцы крови не требуют фракционирования. После размораживания клеточную взвесь отмывают от свободного гемоглобина и диметилсульфоксида в растворе человеческого альбумина или в сыворотке аутокрови больного и используют для трансплантации (Rubinstein et al., 1993, 1994).

- Читать далее "Сохранность гемопоэтических клеток-предшественников. Консервирование пуповинной крови"

Оглавление темы "Практические применение стволовых клеток":
1. Консервирование стволовых клеток. Криоконсервирование
2. Сохранность гемопоэтических клеток-предшественников. Консервирование пуповинной крови
3. Концентрация стволовых клеток в пуповинной крови. Ценность кордовой крови
4. Пуповинная кровь в иммунологии. Трансплантация стволовых клеток пуповинной крови
5. Криоконсервированные стволовые клетки в онкологии. Стволовые клетки в детской гематологии
6. Трансплантация стволовых клеток кордовой крови. Применение пуповинной крови в трансплантологии
7. Гемопоэтические стволовые клетки костного мозга. Аллотрансплантация костного мозга
8. Выживаемость после аллотрансплантации костного мозга. Лечение гемобластозов
9. Эффективность трансплантации костного мозга. Рецидив лейкоза после трансплантации костного мозга
10. Повышение эффективности трансплантации костного мозга. Борьба с рецидивами гемобластозов

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: