Само по себе FHL- или SFHL-активирование in vitro не приводит к образованию зрелых нейронов, и попытались установить, способны ли преформированные с помощью FHL или SFHL стволовые клетки дифференцироваться в холинергические нейроны при трансплантации в ЦНС половозрелой крысы. Для этого была проведена инъекция активированных клеток в нейрогенную зону (гиппокамп) и в несколько ненейрогенных зон, включая предфронтальный участок коры головного мозга, среднюю мембрану и спинной мозг взрослых крыс.

Отслеживание имплантированных клеток проводили с помощью CAG-egftp вектора. Известно, что GFP маркирует одновременно как ультраструктуры клетки, так и клеточные процессы (молекулярный уровень) без утечки и поддается прямой визуализации. Кроме того, GFP-меченые нейральные стволовые клетки поддерживают профиль нейрональной и глиальной дифференциации, идентичный профилю непреобразованных стволовых клеток эмбрионального мозга (Wu et al., 2002).

Через одну-две недели после имплантации 5 х 104 активированных и маркированных нейральных стволовых клеток они были обнаружены в спинном или головном мозге крыс, при этом GFР+-клетки находились, главным образом, возле места инъекции. Процессы миграции и интеграции наблюдались уже через месяц после трансплантации. Пределы миграции менялись в зависимости от места инъекции: при введении в предфронтальный участок коры головного мозга GFР+-клетки располагались в 0,4-2 мм от зоны введения, в случае же имплантации в среднюю мембрану, гиппокамп или спинной мозг клетки мигрировали на гораздо большие расстояния — до 1-2 см.

Трансплантированные клетки локализовались в высокоорганизованных структурах ЦНС, включая фронтальную область коры головного мозга, среднюю мембрану, гиппокамп и спинной мозг. GFP-маркированные нейрональные элементы просматривались уже на 1-й неделе после трансплантации, при этом их количество значительно возросло через 1 месяц после операции. Стереологический анализ показал более высокий уровень выживаемости имплантируемых клеток в различных структурах головного мозга, по сравнению со спинным (Wu et al., 2002).

Авторы провели весьма корректную и показательную "чистку" результатов эксперимента путем исключения возможности получения клетками-хозяевами gfp ДНК или GFP посредством утечки из поврежденных эмбриональных клеток — все GFF^-клетки давали специфически локализованную позитивную реакцию на моноклональные антитела к ядрам человека при негативном ответе на антитела к цитохрому Р450 крысы. Морфологический анализ клеточных трансплантатов показал, что GFР+-клетки в пирамидальном клеточном слое зоны СА1 гиппокампа приобрели типичные характеристики пирамидных нейронов.

Иммуноцитохимически с помощью нейронспецифических маркеров NeuN и TuJl установлено, что большинство GFР-клеток получили нейрональную маркировку через 1 месяц после трансплантации в кору головного мозга, гиппокамп, среднюю мембрану и спинной мозг. Лишь несколько разрозненных GFР+-клеток характеризовались двойной маркировкой с экспрессией астроцитспецифического GFAP. Реакция на галактоцереброзид была негативной у всех СРР+-клеток, что указывает на отсутствие их дифференцировки в линию олигодендроцитов, а негативный результат окрашивания на выявление нестина свидетельствует о том, что через 1 месяц после трансплантации все трансплантированные клетки подверглись дифференцировке.

Чтобы исключить возможность влияния экспрессии GFP в нейральных стволовых клетках на процессы их нейронального преобразования, авторы трансплантировали CAG-egfp-обработанные, но не преформированные FHL клетки в спинной мозг, кору головного мозга, среднюю мембрану и гиппокамп. Около 70% прижившихся клеток через 1 месяц после трансплантации оставались нестинпозитивными, а в изучаемых ненейрогенных зонах приобретали астроглиальный фенотип. Большинство GFР+-холинергических нейронов было выявлено в средней мембране и спинном мозге, а также в зонах головного мозга реципиента с высоким содержанием эндогенных СhAT+-нейронов. Несколько GFP/ChA+-нейронов обнаружены авторами в предфронтальном участке коры головного мозга, где содержится ограниченное количество эндогенных СhА'Р-нейронов. Не удалось выявить GFPyChA'P-HeupoHbi в гиппокампе, где холинергические нейроны вообще отсутствуют.

В спинном мозге некоторые из трансплантированных СhА+-нейронов имели размер и морфологию, неотличимую от эндогенных мотонейронов. Следовательно, образование СhAT+-нейронов было обусловлено воздействием факторов специфического микроокружения зоны локализации исходного клеточного материала (Wu et al., 2002). Кроме того, значительное количество GFPyChAT-нейронов обнаружено в средней мембране (61%) и спинном мозге (55%) при их отсутствии в предфронтальном участке коры головного мозга и гиппокампе. Поскольку средняя мембрана и спинной мозг являются участками ЦНС, содержащими холинергические нейроны, в то время как два других региона их практически не имеют, этот факт подтверждает специфичность регионарной индуцированной дифференцировки нейральных стволовых клеток.

Однако сами авторы не исключают возможность не инструктивного, а селективного эффекта (преимущественное выживание холинергических нейронов в холинергических зонах средней мембраны и спинного мозга). Решение вопроса об использовании FHL-преформированных нейральных стволовых клеток с целью коррекции двигательных нарушений путем функциональной замены погибших мотонейронов с широкомасштабным применением технологий заданного преформирования стволовых клеток эмбрионального мозга для лечения различного рода неврологических заболеваний авторы оставляют на будущее (Wu et al., 2002).

- Читать далее "Трансплантация эмбриональной нервной ткани. Трансплантация клеток в спинной мозг"