Продолжается экспериментальный поиск условий трансдифференцировки стволовых клеток стромы костного мозга в клетки-предшественники нервной и печеночной ткани. Внимание исследователей сосредоточено на комбинациях индукторов дифференцировки и специальных кондиционных средах. В частности, для выделения первичной культуры стромальных клеток отмытые и ресуспендированные в культуральной среде DMEM/F12 (1/1) с 10% фетальной телячьей сывороткой клетки костного мозга высеваются с плотностью 200 000/см2. Через 24 часа неадгезивные клетки удаляются, а прикрепленные к пластику фибробластоподобные клетки культивируются в течение одной недели.

Для дифференцировки клеток стромы костного мозга в нейробласты используется кондиционная среда, полученная путем трехсуточного культивирования первичной культуры эмбриональных фибробластов мыши, а также среда DMEM/F12 (1/1) с 2% фетальной телячьей сывороткой и добавлением 20 нг/мл LIF или 10-6М ретиноевой кислоты (нейроиндукторы, которые применяются для нейральной дифференцировки эмбриональных стволовых клеток мыши и человека) (Fraichard et al., 1995; Pagano et al., 2000). Дифференцировку клеток стромы костного мозга в клетки-предшественники гепатоцитов индуцируют в кондиционной среде, созданной в результате трехсуточного культивирования первичной культуры эмбриональных клеток печени мыши в среде DMEM/F12 (1/1) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (Щегелъская и др., 2002).

Тут следует еще раз отметить, что колониеобразующие клетки стромы костного мозга гетероморфны и могут быть разделены на два типа. К первому типу относятся фибробластоподобные, образующие филоподии клетки с крупными ядрами и одним-двумя ядрышками. Второй тип представлен мелкими клетками веретенообразной формы.

При культивировании клеток обоих типов в кондиционной среде, полученной на фидерном слое первичных эмбриональных фибробластов мыши, на 3-и-4-е сутки в культуре появляются клетки, похожие на нейробласты. На этой стадии они чаще всего имеют веретенообразную форму с одним или двумя длинными отростками, заканчивающимися филоподиями. Реже встречаются пирамидные или звездчатые клетки с короткими дендритами.

Дендриты одних нейробластов имеют характерные расширения (почки роста) и разветвления в своей дистальной части, других — отчетливые конусы роста с филоподиями, с помощью которых происходит рост дендритов. Аналогичные морфологические признаки (почки и конусы роста с филоподиями), присущие нейробластам, дифференцирующимся в нейроны, подробно описаны в работах по нейрогенезу (Будко, 1985). На этом основании некоторые авторы делают вывод, что обнаруживаемые ими в культуре клетки являются нейробластами.

В частности, Е. Щегельская и соавторы (2002) после культивирования первичной культуры стромальных клеток в течение двух недель в сменяемой на каждые З-и-4-е сутки кондиционной среде установили, что часть клеток пролиферирует, сохраняя недифференцированное состояние. Внешне такие клетки были похожи на фибробласты и выявлялись в культуре наряду с дифференцирующимися нейробластами. Большая же часть клеток (около 80%) находилась на разных стадиях дифференцировки в клетки нервной ткани, преимущественно в нейроны. Дендритные отростки этих клеток тесно контактировали между собой, так что постепенно клетки формировали на субстрате участки нервной сети в виде длинных многоклеточных тяжей.

Дендритные отростки нейробластов становились значительно длиннее, некоторые из них в 8-10 раз превышали длину тела самого нейрона. Постепенно увеличивалась доля пирамидных и звездчатых клеток. Дендриты звездчатых клеток разветвлялись. По мнению авторов, более поздняя дифференцировка пирамидных и звездчатых клеток по сравнению с веретенообразными соответствует последовательности этапов нормального нейрогенеза у животных. В результате авторы заключают, что стволовые клетки стромы костного мозга подвергаются индуцированному нейрогенезу, в процессе которого in vitro из нейробластов образуются все три основных типа нейронов. Предшественники нервных клеток были обнаружены и во время культивирования клеток стромы костного мозга в течение 3-4 суток в среде с 2% фетальной сывороткой и 20 нг/мл LIF.

Но в этом случае стволовые клетки делились очень медленно, дифференцировка нейробластов происходила только в 30% случаев и они не образовывали нейрональные сети. Используя в качестве одного из индукторов дифференцировки нервных клеток ретиноевую кислоту, авторы получили в культуре до 25-30% нервных клеток с преобладанием глиальных элементов — астроцитов и олигодендроцитов. Нейроны составляли лишь третью часть от всех нервных клеток, хотя и были представлены всеми тремя типами: веретенообразными, пирамидными и звездчатыми клетками. На 6-е сутки культивирования клеток стромы в среде с ретиноевой кислотой нервные клетки становились более дифференцированными, а у отдельных пирамидных нейронов были обнаружены аксоны, которые и в нормальном нейроонтогенезе появляются позже образования дендритных отростков.

По мнению авторов, несмотря на низкий выход нервных клеток, метод индукции ретиноевой кислотой имеет свои преимущества: олигодендроциты и астроциты выполняют миелинизирующую и питающую функции во время роста дендритов и аксонов и необходимы для нормального формирования нервной ткани. Следовательно, для репарации ее поврежденных участков in vivo лучше использовать суспензию нейронов, обогащенную клетками глии (Щегельская и др., 2002).

- Читать далее "Дифференциация клеток костного мозга. Применение клеток костного мозга при ожогах"