Видовые эмбриональные гибридные клетки. Получение клонов гибридных клеток

В экспериментах по получению внутривидовых эмбриональных гибридных клеток путем слияния ЭСК мыши со спленоцитами взрослого животного (Матвеева и др., 1996) изучена характеристика таких цитогибридов, проведен анализ сегрегации родительских хромосом и дана оценка плюрипотентности гибридного генома (Серов и др., 2001). Для внутривидовых гибридных клеток, полученных от слияния клеток тератокарциномы с соматическими клетками, обычно характерен низкий уровень сегрегации хромосом с тетраплоидным или околотетраплоидным кариотипом (Rousset et al., 1983; Takagi et al., 1983; Forejt et al., 1984; Takagi, 1993; Mise et al., 1996).

Подобный хромосомный состав наблюдался в цитогибридах при слиянии первичных половых клеток с лимфоцитами (Tada et al., 1997). В то же время у межвидовых гибридных клеток, полученных в результате слияния мышиных тератокарциномных клеток с лимфоцитами норки, отмечалась интенсивная сегрегация хромосом соматического партнера (Serov et al, 1990).

Качественно новый этап исследования сегрегации родительских хромосом у внутривидовых гибридов наступил после разработки метода анализа микросателлитов с помощью поли-меразной цепной реакции, благодаря которому на каждую хромосому мыши найдено несколько сотен маркеров, позволяющих надежно дискриминировать любую пару гомологичных хромосом в гибридных клетках (Серов и др., 2001).

Путем слияния стволовых клеток (использовались клетки НМ-1, дефицитные по активности гипоксантинфосфорибозилтрансферазы, 2n = 40, XY, выделенные из бластоцист мышей линии 129/01а) со спленоцитами мышей конгенной линии DD/c удалось получить набор гибридных клонов, морфологически имевших сходство с ЭСК (Magin et al, 1992; Матвеева и др., 1996; Matveeva et al., 1998). Все клоны были выделены на селективной среде, в которой возможен рост только клеток с активной гипоксантинфосфорибозилтрансферазой.

Электрофоретический анализ показал наличие у всех клонов аллельного варианта гипоксантинфосфорибозилтрансферазы, характерного для мышей DD/c (Serov et al., 1994). С помощью цитогенетического анализа было установлено, что из четырех гибридных клонов три имели околодиплоидный набор хромосом. Один околотетраплоидный клон содержал две популяции гибридных клеток, одна из которых была тетраплоидной, а вторая, меньшая — диплоидной (Серов и др., 2001).

эбриональные гибридные клетки

Анализ микросателлитов, позволяющий дискриминировать любую пару гомологичных хромосом мышей 129/01а и DD/c, в гибридных клонах с околодиплоидным набором показал, что в двух клонах произошла отчетливая преимущественная элиминация аутосом соматического партнера. Большинство аутосом в клонах HESS2 и HESS3 имели маркеры линии 129/01а, то есть, плюрипотентного партнера. Исключение составили хромосомы 1 и И: в клонах HESS2 и HESS3, наряду с маркерами НМ-1 клеток, в небольшом количестве присутствовали маркеры соматического партнера.

Такие результаты могут отражать неполноту сегрегации хромосом 1 и И соматического партнера и согласуются с цитогенетическими данными о том, что трисомия по этим хромосомам наблюдается в 30-40% клеток клонов HESS2 и HESS3 (Matueeva et al., 1998). Клон HESS4 существенно отличался по хромосомному составу: многие аутосомы в этом клоне происходили из генома ЭСК (хромосомы 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14 и 17), однако хромосомы 1, 9, И, 12, 15, 16, 18 и 19 были представлены гомологами обоих родителей.

Количественное соотношение микросателлитов, маркирующих эти гомологичные хромосомы, примерно соответствовало 1:1. Это позволило авторам предположить, что один гомолог имеет происхождение из генома ЭСК, а другой — из дифференцированных клеток. В некоторых субклонах клона HESS4 наблюдалось присутствие только маркеров хромосом 18 и 19 соматического партнера. Полученные результаты свидетельствуют, что в клетках клона HESS4, помимо сегрегации хромосом соматического партнера, произошла элиминация одного или обоих гомологов перечисленных выше хромосом плюрипотентного генома, то есть, имела место двусторонняя сегрегация хромосом обоих родителей — явление весьма необычное, поскольку для цитогибридов характерна сегрегация хромосом только одного из родителей (Серов и др., 2001).

Кроме того, после 20-го пассажа все клоны гибридных клеток содержали исключительно маркеры Х-хромосомы соматического партнера, то есть, в клонах произошла замена Х-хромосомы ЭСК на Х-хромосому соматического партнера. Подтверждают этот важнейший факт данные in situ гибридизации с использованием ФИТЦ-меченого зонда, специфичного для Х-хромосомы мыши: позитивный сигнал обнаруживался только на одной хромосоме (Матвеева и др., 2001).

Следует отметить, что на более ранних сроках культивирования (до 15-го пассажа), согласно цитогенетическим данным, во многих клетках присутствовали две Х-хромосомы. Следовательно, использование селективных сред позволяет манипулировать хромосомным составом гибридных клеток и направленно отбирать клоны, несущие единичные хромосомы соматического партнера на фоне генома ЭСК (Серов и др., 2001).

- Читать далее "Хромосомный и генетический набор гибридных клеток. Плюрипотентность гибридных клеток"

Оглавление темы "Дифференциация эмбриональных стволовых клеток":
1. Культивирование эмбриональных стволовых клеток. Участие стволовых клеток в эмбриогенезе
2. Генетически модифицированные стволовые клетки. Участие генов в дифференциации стволовых клеток
3. Гибридные клетки. Цитогибриды
4. Видовые эмбриональные гибридные клетки. Получение клонов гибридных клеток
5. Хромосомный и генетический набор гибридных клеток. Плюрипотентность гибридных клеток
6. Репрограммирование Х-хромосомы гибридных клеток. Плюрипотентность цитогибридов
7. Хромосомная память. Эффективная экспансия стволовых клеток в культуре
8. Спонтанная дифференцировка эмбриональных стволовых клеток. Дифференцировка стволовых клеток
9. Индуцированная дифференциация стволовых клеток. Направленная дифференциация стволовых клеток
10. Селективная дифференциация стволовых клеток. Регуляция дифференцировки стволовых клеток

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: