Генетически модифицированные стволовые клетки. Участие генов в дифференциации стволовых клеток

Пересадки генетически модифицированных эмбриональных стволовых клеток применяются для тестирования клеток-мишеней мутантных генов (Репин, 2001). Культивируемые in vitro ЭСК используются в биотехнологиях по созданию нокаутных мышей. Для этого посредством гомологичной рекомбинации из ЭСК удаляют подлежащий исследованию ген (нокаут) и на селективных средах выделяют клетки, лишенные этого гена. Затем нокаутные ЭСК вводят в бластоцисту или проводят их агрегацию с бластомерами морулы. Полученные таким образом химерные ранние зародыши трансплантируют самкам-реципиентам, и среди новорожденных мышей отбирают особей с гаметами, нуллизиготными по данному гену.

По этой технологии создано множество линий нокаутных мышей, которые широко используются в экспериментальной биологии и экспериментальной медицине. На таких биологических моделях изучается значение тех или иных генов в эмбриональном развитии, а также их роль в механизмах заболеваний и патологических состояний человека. Кроме того, линии нокаутных животных применяются при проведении этапа доклинических испытаний новых способов генотерапии. Например, с помощью трансфекции в геном ЭСК нормального аллеля мутантного гена удается эффективно корригировать мутацию, поражающую систему кроветворения (Rireout, 2002).

Введение в эмбриональные стволовые клетки чужеродных генов позволяет ускоренными темпами создавать линии гомозиготных трансгенных лабораторных животных. Однако следует заметить, что техника направленной рекомбинационной делеции генов надежно отработана пока еще только относительно ЭСК мышей (Capecchi, 1989). С помощью мышиных ЭСК с двойным нокаутом установлена функциональная роль области скопления генов на 7-й хромосоме (копия геномного участка на 19-й хромосоме человека), а также проксимального участка 11-й хромосомы (копия 5q-хромосомы человека) — делеция данных генов в ЭСК мышей позволила оценить функцию их аналогов у человека (Репин, 2001).

Расширились возможности исследования функции генов эмбриогенеза человека, трансфекция которых в геном ЭСК лабораторных животных позволила, в частности, уточнить роль гена crypto в закладке и формировании кардиогенной мезодермы, гена рах-6 — в эмбриогенезе глаза. Составляются первые карты экспрессии генов в незрелых пролиферирующих ЭСК терато-карциномы и бластоцисты мышей, подтверждена подавляющая репрессия в ЭСК генов транссигнализации (Kelli, Rizzino, 2000). Комбинация из 60-80 мутантных ЭСК и 20-30 клеток нормальных доимплантационных мышиных зародышей приводит к развитию химерных эмбрионов, у которых закладки органов состоят из донорских и реципиентных клеток, что позволяет выяснить роль неизвестных генов в гаструляции и органогенезе.

генетически модифицированные стволовые клетки

Направленное выключение материнского и отцовского аллелей генов в ЭСК с помощью векторных рекомбиназ позволило уточнить функции различных генов в раннем периоде эмбриогенеза, а технология направленного переноса неизвестных генов человека в ЭСК мыши способствует открытию новых мутантных генов, ответственных за развитие тяжелой наследственной патологии. С использованием нокаут-метода определено облигатное значение некоторых генов для закладки эмбриональных тканей: gata-4 — для миокарда, gata-1 — для эритроидного ростка кроветворной ткани, myoD — для скелетных мышц, brachyury— для мезодермы, рестрикционных транскриптаз hnf3 и hnf4 — для стволовых клеток печени, rag-2 — для закладки клонов Т- и В-лимфоцитов (Репин, 2001).

Двойная делеция генов в ЭСК открыла доступ к изучению функциональной роли генов зародышевых листков, сегментации и гомеозиса, а трансплантация ЭСК дала возможность получения жизнеспособных межвидовых зародышей-гибридов. С помощью усовершенствованной методики трансплантации единственной донорской ЭСК в 8-клеточный зародыш доказан факт химеризации на клеточном уровне многих органов эмбриона-реципиента (Saburi et. al., 1997). Заметим, что клеточные ростки ткани человека обнаружены в органах мышей-реципиентов и после введения гемопоэтических стволовых клеток человека в бластоцисту (Geiger et al., 1998). Установлено, что у мышиных зародышей в период формирования органов в крови циркулируют плюрипотентные ЭСК.

Не исключено, что их биологическая функция заключается в эмбриональной организации будущей иммунной системы. С помощью ЭСК в лабораторных условиях воспроизведены адекватные модели генетической патологии человека: двойной нокаут гена дистрофина моделирует у мышей мышечную дистрофию Дюшенна, выключение гена atm (контроль синтеза сигнальной киназы хроматина) — атаксию-телеангэктазию. При этом фатальном наследственном заболевании у детей из-за дефектов репарации ДНК развивается дегенерация клеток Пуркинье в мозжечке, что сопровождается инволюцией тимуса вследствие гибели пролиферирующих клеток. Клиника, патофизиология и патоморфология атаксии-телеангэктазии, воспроизведенной с помощью привнесения в ЭСК патологической генетической информации, у мышей-химер соответствуют таковым у человека.

Кроме атаксии-телеангэктазии с использованием ЭСК и нокаутных мышей разработаны экспериментальные модели некоторых наследственных гомозиготных заболеваний человека, связанных с патологией углеводного и липидного обмена, катаболизма аминокислот, выведения меди и билирубина, что значительно расширило возможности экспериментальной медицины на этапе доклинических испытаний новых способов лечения соответствующих болезней человека (Репин, 2001).

- Читать далее "Гибридные клетки. Цитогибриды"

Оглавление темы "Дифференциация эмбриональных стволовых клеток":
1. Культивирование эмбриональных стволовых клеток. Участие стволовых клеток в эмбриогенезе
2. Генетически модифицированные стволовые клетки. Участие генов в дифференциации стволовых клеток
3. Гибридные клетки. Цитогибриды
4. Видовые эмбриональные гибридные клетки. Получение клонов гибридных клеток
5. Хромосомный и генетический набор гибридных клеток. Плюрипотентность гибридных клеток
6. Репрограммирование Х-хромосомы гибридных клеток. Плюрипотентность цитогибридов
7. Хромосомная память. Эффективная экспансия стволовых клеток в культуре
8. Спонтанная дифференцировка эмбриональных стволовых клеток. Дифференцировка стволовых клеток
9. Индуцированная дифференциация стволовых клеток. Направленная дифференциация стволовых клеток
10. Селективная дифференциация стволовых клеток. Регуляция дифференцировки стволовых клеток

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: