Культивирование эмбриональных стволовых клеток. Участие стволовых клеток в эмбриогенезе

При крайне ограниченных фенотипических признаках и отсутствии большинства блоков транссигнализации ЭСК все же экспрессируют некоторые рецепторные молекулы, которые можно использовать для их идентификации. Примечательно, что антигены-маркеры ЭСК у человека и приматов оказались общими. Чаше всего для маркировки ЭСК используют меченые антитела к мембранносвязанным антигенам SSEA-3, SSEA-4 (уникальные липидные антигены, представляющие комплекс гликолипида GL7 с сиаловой кислотой), а также высокополимерные гликопротеиды TRA-1-81, TRA-1-60 (Репин, 2001).

Кроме того, стволовые клетки экспрессируют специфический эмбриональный антиген SSEA-1 и эндогенную щелочную фосфатазу (Resnick et al., 1992), а также специфический транскрипционный фактор Oct4 (Scholer et al., 1990). Последний необходим для поддержания механизмов пролиферации ЭСК — специфический транскрипционный фактор Oct4 активирует экспрессию гена фактора роста фибробластов 4 и стабилизирует экспрессию бокса генов, ответственных за нелимитированную редупликацию ДНК в незрелых клетках (Nichols et al., 1998).

Наиболее важными внутриклеточными маркерными белками являются Oct3, Oct4, Tcf и Groucho, относящиеся к белкам-сайленсерам хроматина (Репин, 2001).

Практически сразу после того как многолетние попытки культивировать стволовые клетки вне организма увенчались успехом и были получены первые культуры стволовых клеток, выделенных из бластоцист мыши (Evans, Kaufman, 1981; Martin, 1981), а также культуры первичных половых клеток (Donovan, 1994), начался этап исследований плюрипотентного потенциала ЭСК при их введении в эмбрионы на ранних стадиях развития. Было показано, что на стадии морулы и бластоцисты ЭСК способны формировать химерные зародыши, в которых потомки донорских ЭСК выявляются во всех соматических тканях и даже в гаметах (Robertson, Bradley, 1986; Allan, 1987; Robertson, 1987; Joyner, 1993; Hoganet al, 1994). Таким образом, в биологии развития с помощью ЭСК был установлен "мост" между экспериментальными исследованиями in vivo и in vitro, что значительно расширило возможности изучения процессов закладки первичных тканей и органов, их дифференцировки и эмбрионального органогенеза (Серов и др., 2001).

эбриональные стволовые клетки

Четко установлено, что in vivo в процессе эмбриогенеза ЭСК интегрируются в клеточную массу раннего зародыша, а их производные обнаруживаются во всех органах и тканях. ЭСК колонизируют в химерном зародыше линию половых клеток, потомки которых образуют полноценные яйцеклетки и спермин. Эмбриональные стволовые клетки клоногенны — единичная ЭСК способна создать генетически идентичную колонию клеток с молекулярными маркерами, к которым относится экспрессия гена oct4 и щелочной фосфатазы, высокая активность теломеразы, а также экспрессия определенных эмбриональных антигенов.

Для изучения механизмов эмбриогенеза с помощью стволовых клеток разработана методика химеризации морулы путем создания биологической конструкции, снаружи которой располагается слой тетраплоидных бластомеров реципиента, а внутрь вводятся донорские ЭСК. Таким образом, трофобласт формируется из потомков тетраплоидных бластомеров реципиента, что обеспечивает имплантацию и плацентацию, а донорские ЭСК выступают в роли внутренней клеточной массы, из которой образуется тело жизнеспособного зародыша и линия первичных прогениторных половых клеток (Дыбан А., Дыбан 77., 2002).

Исследовательская ценность эмбриональных стволовых клеток заключается не только в том, что при манипуляциях in vitro с их геномом сохраняется плюрипотентность, но и в том, что при этом сберегается способность ЭСК участвовать в образовании первичных половых клеток химерного зародыша. Показано, что потомки всего одной генетически модифицированной ЭСК заселяют все первичные зачатки и формирующиеся ткани химерного эмбриона, полученного посредством агрегации или кокультивирования этой клетки с 8-клеточным зародышем (Saburi et. al., 1997). При трансплантации в морулу мышей ЭСК, трансфецированных геном зеленого флуоресцентного протеина, флуоресцирующие потомки этой клетки были обнаружены во всех исследуемых тканях развивающегося эмбриона (Shimada, 1999). Трансплантация ЭСК в морулу позволяет создавать жизнеспособных мышей, организм которых состоит только из потомков донорской ЭСК (Nagy, 1990; Eggan, 2001), что открывает перспективы для различных вариантов терапевтического клонирования.

Сейчас такой методический подход успешно применяется для изучения проблем биологии развития, в частности, с его помощью проводят анализ механизмов генетической инактивации Х-хромосомы или эпигенетической нестабильности ЭСК. Трансплантация ЭСК в ранний зародыш используется и в биотехнологиях сельского хозяйства, а также в экспериментах по генотерапии (Дыбан А., Дыбан П., 2002).

- Читать далее "Генетически модифицированные стволовые клетки. Участие генов в дифференциации стволовых клеток"

Оглавление темы "Дифференциация эмбриональных стволовых клеток":
1. Культивирование эмбриональных стволовых клеток. Участие стволовых клеток в эмбриогенезе
2. Генетически модифицированные стволовые клетки. Участие генов в дифференциации стволовых клеток
3. Гибридные клетки. Цитогибриды
4. Видовые эмбриональные гибридные клетки. Получение клонов гибридных клеток
5. Хромосомный и генетический набор гибридных клеток. Плюрипотентность гибридных клеток
6. Репрограммирование Х-хромосомы гибридных клеток. Плюрипотентность цитогибридов
7. Хромосомная память. Эффективная экспансия стволовых клеток в культуре
8. Спонтанная дифференцировка эмбриональных стволовых клеток. Дифференцировка стволовых клеток
9. Индуцированная дифференциация стволовых клеток. Направленная дифференциация стволовых клеток
10. Селективная дифференциация стволовых клеток. Регуляция дифференцировки стволовых клеток

Ждем ваших вопросов и рекомендаций: